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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2012年
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中国明对虾核转录因子NF-kB家族基因在免疫调控中的功能研究

王冬冬  
【摘要】:核转录因子NF-κB家族基因控制着无脊椎动物多条重要的免疫信号通路,产生免疫效应因子来抵抗外界的病原刺激。本论文以中国明对虾为研究对象,采用分子克隆、real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)、RNAinterference(RNAi)和suppression subtractive hybridization(SSH)等技术,对NF-κB转录因子在对虾抗病免疫中的调控作用进行研究,为阐明对虾的先天免疫机制奠定基础。本论文取得的主要进展有: 1.利用rapid-amplification of cDNA ends(RACE)等方法克隆到中国明对虾Relish基因的第二种cDNA——FcRelish2。与已报道的FcRelish比较,FcRelish2除含有完整的Rel homology domain(RHD)、核定位信号nucleus localization signal(NLS)外,还含有六个锚蛋白重复序列ankyrin repeat(sANKs)、死亡结构域deathdomain(DD)以及caspase cleavage site。多序列比对和系统进化分析表明FcRelish2与节肢动物的Relish同源蛋白有很高的相似性。对Relish基因组DNA序列的结构分析表明,FcRelish和FcRelish2为Relish基因mRNA的两种可变剪接形式;Relish基因组DNA含有一个启动子序列、一个转录起始位点和多个转录因子结合位点,其中在Relish基因中含有Dorsal转录因子结合位点。 2.通过real-time PCR的方法检测了不同抗菌肽Penaeidin3(Pen3)、Penaeidin5(Pen5)、crustin和anti-lipopolysaccharide factor(ALF)在注射两种不同类型细菌(G+菌——溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和G-菌——鳗弧菌Vibrio anguillarium)后的转录表达变化,结果表明不仅不同抗菌肽在同种细菌注射后的表达变化模式不同,而且同一种抗菌肽在不同细菌注射后的表达变化也不相同。G+菌、G-菌和对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的注射均能引起Relish基因的表达变化,Relish基因可以调控不同类型抗菌肽的转录表达。 3. G+菌、G-菌和WSSV的注射均能引起Dorsal基因的表达变化,但G-菌注射引起的Relish表达反应比Dorsal更快。Dorsal基因也能调控不同类型抗菌肽的转录表达。 4.利用同源克隆和RACE等方法首次在对虾中克隆到NF-κB家族的抑制蛋白Cactus基因的cDNA——FcCactus。FcCactus含有ANKs等重要的IκB同源蛋白特征,与其它七种节肢动物的IκB同源蛋白具有很高的相似性。FcCactus基因的mRNA在被检测的所有组织中都有表达,且在肌肉、血细胞、心脏和淋巴器官中的表达量最高。G+菌、G-菌和WSSV的注射均能引起FcCactus的表达变化,FcCactus能调控不同类型抗菌肽和抗病毒因子AV的转录表达。 5.利用RNAi的方法研究Dorsal、Relish和Cactus基因三者的功能关系。结果表明,Dorsal被干扰后可引起Relish2的下调表达和Cactus的上调表达;Relish被干扰后可引起Cactus的上调表达,但不能引起Dorsal的表达变化;Cactus被干扰后均可引起Relish和Dorsal基因的上调表达。推测Dorsal可能调控Relish基因的转录表达,Cactus、Dorsal和Relish基因之间在功能上是相互联系的。 6.首次结合RNAi和SSH的方法,建立了Relish-RNAi后的正向和反向消减文库,筛选到多种受Relish调控的基因。正向文库筛选到43个unique基因,反向文库筛选到57个unique基因。选取其中的12个差异表达基因进行半定量RT-PCR检测的结果表明,早期表皮蛋白ECP1和ECP5、Toll样受体TLRP、C型凝集素受体CLR、凝血栓敏感蛋白TSP和抗病毒因子AV等基因在Relish-RNAi后的表达量下调;而S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS、凝集素carcinolectin5a和5b-5等基因在Relish-RNAi后的表达量上调。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S917.4

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【引证文献】
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