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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2014年
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凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析

刘敬文  
【摘要】:凡纳滨对虾作为我国养殖产量最高的种类,在对虾养殖中占有举足轻重的地位,其可持续养殖一直为是对虾养殖业追求的目标。然而由于优良种质的缺乏以及对虾病害的频发严重影响着养殖业的健康可持续发展。对虾白斑综合症病毒(WSSV)以其致死率高、感染范围广、传播速率快、极难治愈的特征成为对虾养殖业的头号杀手。培育具有WSSV抗性的对虾品系用于对虾养殖业,是从根本上解决种质和病害问题的唯一途径。由于抗性性状选择的复杂性,分子标记技术可以辅助选育工作,避免选育的盲目性并增加选育的进程。单核苷酸多态性(SNP)被认为是在遗传育种中最具发展前景的分子标记。本研究在凡纳滨对虾多个转录组数据的基础上,以选育品种科海一号的多家系种质库资源作为研究对象,对免疫相关基因SNPs进行了验证及筛选,一方面研究了对虾重要免疫效应因子ALFs在应答WSSV刺激时的表达变化及其多态性与抗性的相关分析,另一方面以免疫信号通路和多个效应因子基因为目标进行了抗性关联分析,以期获得与对虾抗WSSV相关的SNP标记,以指导对虾的抗性育种。主要进展如下: 1、根据基因注释信息,从solexa测序和454测序的数据库中分别筛出156条和86条unigenes,共计242条unigenes,其中56条为免疫信号通路相关基因,186条为免疫效应因子基因。通过对这些基因序列进行进一步的生物信息学分析,获得含1644个SNPs (868个来自solexa测序数据库,776个来自454测序数据库)的免疫基因的SNPs初级库。从初级库中随机选取72个位点进行了验证,确定以Q20(solexa)和duel min≥9(454)作为筛选高质量SNPs (预测准确率85%)的条件。将unigenes序列与已有的部分基因组序列进行了比对,剔除无法在基因组序列中进行定位的位点,最终确定了由681个SNPs组成的免疫基因候选标记库(solexa中593个,454中88个)。 2、对从转录组中获得的6个ALFs (nLvALF1、2、4、5、6、7)基因进行了序列验证,这6个ALFs的开放阅读框(ORF)分别编码123、94、120、124、123、122个氨基酸,它们的ORF中均含有ALF保守功能结构域-LPS结合结构域(LBD),除nLvALF6外其余五种ALFs的LBD均呈现正电性。序列比对和系统进化分析表明本研究中只有nLvALF4、7为已有报道的LvALF,其余4种均为新的亚型且与中国对虾ALFs具有高度的相似性和同源性。6种ALFs在9种组织(Oka、肝胰脏、鳃、血细胞、肠、胃、心脏、表皮、眼柄)中表达存在明显差异。在WSSV感染后36-72h,感染组的nLvALF1、2、4、5、6表达量均显著高于对照组(P0.05),而nLvALF7则为下调表达。推测各亚型ALFs发挥了不同程度的作用。 3、以科海一号多家系种质库个体为材料进行了WSSV感染实验,共历时19天,取初期死亡的48尾对虾作为易感组,最后存活的48尾作为抗性组材料,对两组进行了病毒拷贝数检测发现其拷贝数存在极显著差异(P0.01),推测抗性组体内发生了有效的病毒清除过程。将ALFs基因序列与基因组信息进行比对及拼接后获得了不同ALFs的基因组序列,然后通过扩增、测序获得了较完整的nLvALF1、2、4、6、7基因组序列及SNPs分布信息。凡纳滨对虾的nLvALFs具有较高的多态性,平均每21bp存在一个SNP。选取这些ALFs的部分SNPs在抗性组和易感组中进行了分型,结果表明,nLvALF1内含子I中的位点g.1361-TC、g.1370-TC、g.1419-TA的等位基因分布频率在易感组和抗性组间存在显著差异,其抗性优势等位基因分别为C、C、A。nLvALF2及nLvALF6中也发现了与WSSV易感/抗性关联的SNPs且均位于3’ UTR,nLvALF2中g.2422AG、g.2466TC和g.2529GA抗性优势基因型分别为AA、TT、AA,nLvALF6中g.2994TA的AT型与易感性相关。nLvALF1的SNP位点g.1415-CA和g.1419-TA组成的单倍型CT与科海一号对WSSV易感性显著相关。 4、通过高通量SNaPshot分型技术对筛选出的三条主要免疫信号通路基因(JAK/STAT、Toll、IMD pathways)的SNPs和主要免疫效应因子SNPs进行了分型,进而分析了各SNPs与WSSV抗性/易感性的关联性,结果表明,位点unigene30237(STAM,3’ UTR)和unigene16729(TRAF6, nsSNP)的基因型及等位基因型均与WSSV抗性显著相关(P0.05),位点unigene15411(TLR, sSNP)的G等位基因在抗性组的发生频率远高于易感组(P0.05),位点Unigene26970(Hemocyanin)的CT型、Unigene34569(Cu/Zn SOD, sSNP)的AA型与WSSV抗性相关(P0.05),位点Unigene34129-1(未知基因, sSNP)的CT型及T等位基因型在抗性组中的频率显著高于易感组(P0.05)。 本研究为ALFs在对虾抗病毒免疫机制的功能研究提供了一定的辅助作用,通过关联分析获得的差异SNPs可作为科海一号WSSV抗性品种选育的分子标记。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S917.4

【参考文献】
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