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《中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)》 2017年
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基于高通量测序和形态学的黄渤海沉积物中纤毛虫生物多样性及分布特征研究

黄平平  
【摘要】:纤毛虫是海洋中形态多样和功能重要的单细胞真核微生物,是研究真核微生物多样性和分布格局的一大类典型生物,因此备受关注。随着研究方法的革新,尤其是分子生物学技术的应用,极大拓展了对纤毛虫多样性和分布特征的认识。然而,传统的形态学方法和新兴的分子手段所揭示的纤毛虫多样性和群落结构的差异有哪些?造成差异的主要因素是什么?这些都是亟待解答的科学问题。本文首次结合了形态学观察、核糖体DNA和cDNA高通量测序三种方法,从单个站位和断面水平上对比分析了沉积物中纤毛虫的多样性和群落结构差异,确定并阐释纤毛虫群落结构的差异及驱动因素。据此,提出了以形态观察和cDNA高通量测序为最优研究方案,选定黄海和渤海的17个站位作为研究对象,探讨底栖纤毛虫多样性和分布特征及其与环境因子的关系。首先,以南黄海的单个站位为研究对象,从方法学入手,详细分析了三种方法所得的海洋沉积物中纤毛虫多样性和群落结构差异。结果表明:形态学方法获得8纲、20目、30科、36属共97种纤毛虫;通过DNA高通量测序检获了10纲、28目、55科、76属共174个纤毛虫OTUs;而通过cDNA高通量测序获取的纤毛虫多样性最高,涉10纲、31目、68科、99属共284个OTUs。研究发现,形态学方法检获的纤毛虫均为底栖生纤毛虫;两种分子手段检获的多样性更高,群落结构更为近似,覆盖了形态学鉴定所获的绝大部分类群。相较于此,DNA高通量测序还检获了序列比例高达90%的浮游生纤毛虫,可能源于包囊或死亡沉降的纤毛虫;而cDNA测序检获了约7%的浮游生纤毛虫序列。较之DNA测序,cDNA法检获的底栖生纤毛虫在群落结构上与形态学结果更为接近。本研究表明,分子手段有助于更全面地揭示沉积物中的纤毛虫多样性,DNA测序可同时揭示休眠包囊、胞外DNA及过去群落的信息,而cDNA测序在研究纤毛虫活动虫体的多样性上更有优势。进而,选取了黄渤海一个断面环境差异明显的5个站位,对比分析了三种方法所获得的纤毛虫多样性和群落结构的差异,比较了三种方法所揭示的纤毛虫对环境变化的响应,以期提出进行纤毛虫多样性及其与环境因子关系研究的最佳技术方案。结果显示:形态学方法获得的纤毛虫多样性最低(79种),均为底栖生种类;DNA测序方法次之(308个OTUs),其中以浮游生为主的舞毛亚纲和寡毛亚纲纤毛虫OTUs占总OTUs数的27%,单个站位平均序列比例达66%;cDNA测序方法所获纤毛虫的多样性最高(628个OTUs),其中舞毛亚纲和寡毛亚纲的OTUs占总OTUs数的13%,单个站位平均序列比例约占12%。形态学方法和cDNA测序方法均显示,黄海冷水团内两站位的纤毛虫群落结构更为相似,渤海两站位与黄渤海交界处一站位的纤毛虫群落结构更为相似,这一点与该区域底栖生物的一般分布特点吻合。而DNA测序所获结果则未见此一分布特点,且部分站位中通过形态学和cDNA测序方法检获的一些类群未能通过DNA测序检获。三种方法中,单一方法检获的共有纤毛虫物种数/OTUs数仅占总物种数/OTUs数的5%-8%,而其相对丰度却高达20%-90%,显示优势类群具有更高的扩布能力。综上,cDNA测序方法和形态学方法所得结果较为一致,cDNA测序方法是揭示纤毛虫多样性和群落结构的一种重要手段,结合两种方法可更为全面地分析纤毛虫活动虫体的多样性,探究其分布与环境因子的关系。在方法学比较研究的基础上,结合形态学方法和cDNA高通量测序方法,进一步分析了黄海和渤海17个站位的底栖生纤毛虫多样性、群落结构和分布特征,探讨纤毛虫分布与环境因子的关系。结果表明,形态学方法在17个站位共检获216种底栖纤毛虫,而cDNA高通量测序方法检获了966个纤毛虫OTUs;将浮游生为主的舞毛亚纲和寡毛亚纲纤毛虫去除后,仍有861个底栖生纤毛虫OTUs。研究发现,黄渤海底栖生纤毛虫优势类群主要为前口纲、寡膜纲、裂口纲和腹毛亚纲纤毛虫,两种方法揭示的相对丰度最高的类群均为前口纲纤毛虫。对形态学方法所获得的物种-丰度数据,以及cDNA高通量测序所获得的底栖生纤毛虫OTUs-序列数进行聚类分析显示,cDNA高通量测序结果可将17个站位明确分为冷水团内外的两组,冷水团内站位的底栖生纤毛虫群落结构更为一致,冷水团外站位的群落结构更为相似,与该区域底栖生物的一般分布特点吻合;而形态学结果则未揭示一特点。统计分析结果表明,纤毛虫物种数/OTUs数、香农-威纳指数和Margalef指数均与沉积物中值粒径呈显著正相关,与沉积物中的氮含量、有机质含量呈显著负相关。BIOENV分析表明,冷水团内外具有显著差异的温度、盐度和水深是造成纤毛虫群落结构差异的主要环境因子组合。总体上,与DNA高通量测序方法相比,cDNA高通量测序方法所得的海洋底栖纤毛虫群落结构和分布特点与形态学方法所获结果较为一致,但检获了更高的纤毛虫多样性。然而,cDNA高通量测序结果中依然有一定数量的浮游纤毛虫,这些序列的存在可能在某种程度上影响对底栖纤毛虫多样性的评估。因此,未来研究中需要进一步改进纤毛虫分子多样性研究的技术方案,如去除胞外遗传物质,增加扩增片段长度,优化序列分析方法等,以期更为恰切地评估纤毛虫等真核微生物的生物多样性和群落结构及分布特征。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q958.8;Q78

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