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栉孔扇贝两种模式识别受体基因的克隆与表达的研究

苏建国  
【摘要】:针对栉孔扇贝养殖中出现的病害问题,从机体本身的免疫机制着手,深入探讨其免疫识别机理,为进一步研究免疫信号传导,深入了解扇贝先天性免疫的机制,为制定合理的养殖策略提供坚实的理论基础;丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容,为许多疾病发病机制及其防治研究提供新的思路;希望利用扇贝这种缺乏获得性免疫的无脊椎动物来研究先天性免疫识别分子的功能,在高等和低等生物间寻找具有相同功能的同源分子,为揭示和阐明先天性免疫这一已存在数十亿年,从低等生物开始出现一直到人类仍然保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。 本研究采用 EST 测序和 cDNA 末端快速扩增(RACE)的方法,从栉孔扇贝中克隆到识别革兰氏阴性菌脂多糖和真菌葡聚糖的脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的 cDNA 全长。采用同源克隆和 RACE 的方法,结合 Virtual Northern Blotting技术,从栉孔扇贝中克隆到识别革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌肽聚糖的肽聚糖识别蛋白(PGRP-S1)基因的 cDNA 全长。采用生物信息学的方法,对 LGBP 和PGRP-S1 的 mRNA 序列和氨基酸序列进行分析。采用 RT-PCR 检测了血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺组织中的 LGBP 和 PGRP-S1 的表达差异。采用 RT-PCR 检测了在革兰氏阴性菌及真菌刺激下,LGBP 的表达规律;在革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌刺激下,PGRP-S1 的表达规律。 栉孔扇贝 LGBP 基因的 cDNA 全长为 1850 核苷酸(nt),5’-非翻译区(UTR)有 127 nt,包含 3 个“终止密码子”;接着为一个 1323 nt 的开放阅读框(ORF);随后为 400 nt 的 3’-UTR,包括一个多聚腺苷酸信号序列(AATAAA)和 ploy A尾巴。经 BLASTN 分析,其核苷酸保守性很差。LGBP mRNA 二级结构的自由能为-309.0 kkcal/mol。 栉孔扇贝 LGBP 基因的 ORF 编码 440 个氨基酸(aa)的蛋白。该蛋白的分子量(MW)为 47.16 kDa;等电点(PI)为 5.095。该蛋白没有信号肽;具有一个跨膜域(146-180);一个 Glyco_hydro_16 结构域(276-437),该结构域有一个虚拟的二硫键,具有多个氯离子和镉离子的结合位点,没有 alpha 螺旋而具有多 苏建国 栉孔扇贝两种模式识别受体基因的克隆与表达的研究 博士学位论文 VI 个 beta 折叠。LGBP 有一个 N-糖基化位点(294-296)、一个脂多糖结合位点 (313-330)及一个葡聚糖结合位点(341-350)。该蛋白 C-端富含色氨酸(6.66 %, 320-440)。该蛋白的二级结构包含螺旋构象 10%、折叠构象 17%、转角构象 21% 及无规则卷曲 53%。 经 BLASTP 分析,栉孔扇贝 LGBP 与兰虾 LGBP 的同源性最高(E=5e-72), 氨基酸序列的保守性高。栉孔扇贝 LGBP 还与淡水栖水蚤的革兰氏阴性菌结合蛋 白(GNBP)、蚤状水蚤的 GNBP、粉红粗毛水蚤的 GNBP、小房皮海绵的 β-1,3- 葡聚糖结合蛋白(BGBP)及普通蚯蚓 LGBP 的遗传距离较近。与栉孔扇贝 LGBP 相关的蛋白现已在细菌、真菌、海绵动物、环节动物、节肢动物、棘皮动物等中 报道。在软体动物中本研究属首次报道。 栉孔扇贝 PGRP-S1 基因的 cDNA 全长为 1073 nt,5’-UTR 为 59 nt,包含两 个“终止密码子”;接着为一个 759 nt 的 ORF;随后为 255 nt 的 3’-UTR,包括一 个多聚腺苷酸信号序列及 Ploy A 尾巴。经 BLASTN 分析,其核苷酸保守性很差。 PGRP-S1 mRNA 二级结构的自由能是-194.3 kkal/mol。 栉孔扇贝 PGRP-S1 基因的 ORF 编码 252 aa 的蛋白。该蛋白的 MW 为 27.88 kDa;PI 为 8.255。该蛋白具有 22 aa 的信号肽;一个 Zn2+位点(H112、H221 及 C229);可能形成二硫键的两个保守的半胱氨酸位点(C119 及 C125);两个交叉 重叠的结构域(PGRP 结构域和 Ami_2 结构域)。PGRP-S1 的 PGRP 结构域分为 3 个亚结构域:PGRP-I、PGRP-II 和 PGRP-III;具有 alpha-螺旋 4 个,beta-片层 5 个。该蛋白的二级结构包含螺旋构象 11%,折叠构象 24%,转角构象 37%,无 规则卷曲 29%。 经 BLASTP 分析,栉孔扇贝 PGRP-S1 与果蝇和人 PGRPs 具有高度的同源性, 相同率为 23%到 46%,相似性为 46%到 63%。栉孔扇贝 PGRP-S1 与人的 PGRP-L、 PGRP-Iα 及 PGRP-Iβ 遗传距离较近。在非冗余蛋白库中,具有 PGRP 结构域的物 种有细菌、节肢动物和脊索动物这三大类;具有 Ami_2 结构域的物种有病毒、 细菌、节肢动物和脊索动物这四大类。栉孔扇贝 PGRP-S1 是本实验室在软体动 物中报道的又一个 PGRP 基因。我们将 PGRPs 的保守性向下延伸一个门到软体 动物门。


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