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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2005年
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栉孔扇贝两种模式识别受体基因的克隆与表达的研究

苏建国  
【摘要】:针对栉孔扇贝养殖中出现的病害问题,从机体本身的免疫机制着手,深入探讨其免疫识别机理,为进一步研究免疫信号传导,深入了解扇贝先天性免疫的机制,为制定合理的养殖策略提供坚实的理论基础;丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容,为许多疾病发病机制及其防治研究提供新的思路;希望利用扇贝这种缺乏获得性免疫的无脊椎动物来研究先天性免疫识别分子的功能,在高等和低等生物间寻找具有相同功能的同源分子,为揭示和阐明先天性免疫这一已存在数十亿年,从低等生物开始出现一直到人类仍然保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。 本研究采用 EST 测序和 cDNA 末端快速扩增(RACE)的方法,从栉孔扇贝中克隆到识别革兰氏阴性菌脂多糖和真菌葡聚糖的脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的 cDNA 全长。采用同源克隆和 RACE 的方法,结合 Virtual Northern Blotting技术,从栉孔扇贝中克隆到识别革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌肽聚糖的肽聚糖识别蛋白(PGRP-S1)基因的 cDNA 全长。采用生物信息学的方法,对 LGBP 和PGRP-S1 的 mRNA 序列和氨基酸序列进行分析。采用 RT-PCR 检测了血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺组织中的 LGBP 和 PGRP-S1 的表达差异。采用 RT-PCR 检测了在革兰氏阴性菌及真菌刺激下,LGBP 的表达规律;在革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌刺激下,PGRP-S1 的表达规律。 栉孔扇贝 LGBP 基因的 cDNA 全长为 1850 核苷酸(nt),5’-非翻译区(UTR)有 127 nt,包含 3 个“终止密码子”;接着为一个 1323 nt 的开放阅读框(ORF);随后为 400 nt 的 3’-UTR,包括一个多聚腺苷酸信号序列(AATAAA)和 ploy A尾巴。经 BLASTN 分析,其核苷酸保守性很差。LGBP mRNA 二级结构的自由能为-309.0 kkcal/mol。 栉孔扇贝 LGBP 基因的 ORF 编码 440 个氨基酸(aa)的蛋白。该蛋白的分子量(MW)为 47.16 kDa;等电点(PI)为 5.095。该蛋白没有信号肽;具有一个跨膜域(146-180);一个 Glyco_hydro_16 结构域(276-437),该结构域有一个虚拟的二硫键,具有多个氯离子和镉离子的结合位点,没有 alpha 螺旋而具有多 苏建国 栉孔扇贝两种模式识别受体基因的克隆与表达的研究 博士学位论文 VI 个 beta 折叠。LGBP 有一个 N-糖基化位点(294-296)、一个脂多糖结合位点 (313-330)及一个葡聚糖结合位点(341-350)。该蛋白 C-端富含色氨酸(6.66 %, 320-440)。该蛋白的二级结构包含螺旋构象 10%、折叠构象 17%、转角构象 21% 及无规则卷曲 53%。 经 BLASTP 分析,栉孔扇贝 LGBP 与兰虾 LGBP 的同源性最高(E=5e-72), 氨基酸序列的保守性高。栉孔扇贝 LGBP 还与淡水栖水蚤的革兰氏阴性菌结合蛋 白(GNBP)、蚤状水蚤的 GNBP、粉红粗毛水蚤的 GNBP、小房皮海绵的 β-1,3- 葡聚糖结合蛋白(BGBP)及普通蚯蚓 LGBP 的遗传距离较近。与栉孔扇贝 LGBP 相关的蛋白现已在细菌、真菌、海绵动物、环节动物、节肢动物、棘皮动物等中 报道。在软体动物中本研究属首次报道。 栉孔扇贝 PGRP-S1 基因的 cDNA 全长为 1073 nt,5’-UTR 为 59 nt,包含两 个“终止密码子”;接着为一个 759 nt 的 ORF;随后为 255 nt 的 3’-UTR,包括一 个多聚腺苷酸信号序列及 Ploy A 尾巴。经 BLASTN 分析,其核苷酸保守性很差。 PGRP-S1 mRNA 二级结构的自由能是-194.3 kkal/mol。 栉孔扇贝 PGRP-S1 基因的 ORF 编码 252 aa 的蛋白。该蛋白的 MW 为 27.88 kDa;PI 为 8.255。该蛋白具有 22 aa 的信号肽;一个 Zn2+位点(H112、H221 及 C229);可能形成二硫键的两个保守的半胱氨酸位点(C119 及 C125);两个交叉 重叠的结构域(PGRP 结构域和 Ami_2 结构域)。PGRP-S1 的 PGRP 结构域分为 3 个亚结构域:PGRP-I、PGRP-II 和 PGRP-III;具有 alpha-螺旋 4 个,beta-片层 5 个。该蛋白的二级结构包含螺旋构象 11%,折叠构象 24%,转角构象 37%,无 规则卷曲 29%。 经 BLASTP 分析,栉孔扇贝 PGRP-S1 与果蝇和人 PGRPs 具有高度的同源性, 相同率为 23%到 46%,相似性为 46%到 63%。栉孔扇贝 PGRP-S1 与人的 PGRP-L、 PGRP-Iα 及 PGRP-Iβ 遗传距离较近。在非冗余蛋白库中,具有 PGRP 结构域的物 种有细菌、节肢动物和脊索动物这三大类;具有 Ami_2 结构域的物种有病毒、 细菌、节肢动物和脊索动物这四大类。栉孔扇贝 PGRP-S1 是本实验室在软体动 物中报道的又一个 PGRP 基因。我们将 PGRPs 的保守性向下延伸一个门到软体 动物门。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q785

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【引证文献】
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2 张樱;三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与表达研究[D];宁波大学;2011年
【参考文献】
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10 刘晓萍,王玉贞,韩彦弢,于业军,王跃军,王春波;扇贝多肽在体外对免疫细胞活性的影响及其抗紫外线的氧化损伤作用[J];海洋与湖沼;2001年04期
【共引文献】
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3 刘占才;孔祥会;;环境因子对鱼类吞噬细胞作用的影响[J];安徽农业科学;2007年11期
4 王芸;李健;刘淇;王群;;5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响[J];安徽农业科学;2007年26期
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6 雷晓柱;刘存歧;王伟伟;张亚娟;王军霞;;3种虾类超氧化物歧化酶同工酶比较[J];安徽农业科学;2008年26期
7 田娟;冷向军;李小勤;刘昌盛;罗从彦;崔惟东;高晓;;复方中草药制剂对草鱼生长性能·肌肉成分和血清非特异性免疫的影响[J];安徽农业科学;2008年28期
8 何颖;陈忠伟;高建峰;胡庭俊;刘伟;赵武;胡帅;赵武;关忠谊;李斌;梁家幸;;马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用[J];安徽农业科学;2008年31期
9 霍光明;张李阳;茆建强;陈玉胜;饶玉鹏;阮鸣;;芝芪菌质对日本沼虾生产性能和机体免疫的影响[J];安徽农业科学;2009年31期
10 赵明军;张洪玉;周状;;中草药对水产动物疾病防治的药效学研究综述[J];安徽农业科学;2009年36期
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2 沈文英;李卫芬;徐正海;;益生菌对三角帆蚌生长和免疫酶活性的影响[A];全国畜禽和水产养殖污染监测与控制治理技术交流研讨会论文集[C];2008年
3 潘清清;邱庆连;刘问;郝珂;陈昌福;钱冬;;免疫增强剂在青蟹越冬养殖疾病防控中的应用[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
4 郭志勋;李卓佳;林黑着;叶乐;冯娟;杨莺莺;陈永青;;芽孢杆菌对凡纳对虾生长及免疫的影响[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年
5 邹远超;李融;危起伟;;试论我国鲟鱼养殖产业的可持续发展[A];中国工程院第77场工程科技论坛·2008水产科技论坛——渔业现代化与可持续发展论文集[C];2008年
6 刘存歧;王伟伟;张亚娟;王鹏;张婧;;日本对虾肌肉中SOD分离条件的探索[A];中国动物学会北方七省市动物学会学术研讨会论文集[C];2005年
7 徐彪;杨红生;;一株形态特殊的细菌对栉孔扇贝致病性的初步研究[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第十次学术讨论会论文集[C];2001年
8 张金龙;张效生;崔茂盛;冯建忠;;酵母多聚糖生物学活性及应用前景[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(下册)[C];2010年
9 王学锋;李纯厚;贾晓平;蔡文贵;;重金属污染对鱼类的胁迫效应研究进展[A];十一五农业环境研究回顾与展望——第四届全国农业环境科学学术研讨会论文集[C];2011年
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1 李蓉;一种新型虫草生物学及其活性物质的研究[D];中国海洋大学;2009年
2 张彦娇;盐度和温度对大菱鲆非特异性免疫力的影响及淡水螯虾相关免疫因子的研究[D];中国海洋大学;2010年
3 张琴;刺参(Apostichopus japonicus Selenka)高效免疫增强剂的筛选与应用[D];中国海洋大学;2010年
4 常杰;对虾和刺参敏感免疫学指标的筛选和评价[D];中国海洋大学;2010年
5 吴成龙;皱纹盘鲍抗氧化基因的克隆及其在营养调控下表达的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 孟宪红;中国对虾“黄海2号”对WSSV的抗病性分析[D];中国海洋大学;2010年
7 赖晓芳;中国对虾应答WSSV侵染相关基因的研究[D];中国海洋大学;2010年
8 孙爱;大黄鱼(Pseudosciaena crocea)三种组织细胞系的建立、鉴定及其应用的初步研究[D];中国海洋大学;2010年
9 王丽燕;面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)对中国卤虫(Artemia sinica)抗弧菌感染的影响与酚氧化酶原在卤虫早期发育过程中表达时相的研究[D];中国海洋大学;2010年
10 王孟强;栉孔扇贝(Chlamys farreri) Toll样受体信号通路免疫功能研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2010年
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1 谷珉;仿刺参(Apostichopus japonicus)免疫增强剂的体外筛选与养殖试验的评估[D];中国海洋大学;2010年
2 白楠;凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、仿刺参Apostichopus japonicus免疫增强剂使用频率和免疫疲劳的研究[D];中国海洋大学;2010年
3 王娜;扇贝养殖海区浮游生物和大型海藻携带AVNV的检测及浮游生物多样性分析[D];中国海洋大学;2010年
4 刘君;对虾抗白斑综合征病毒益生菌的筛选及其作用效果[D];中国海洋大学;2010年
5 杜以帅;酶解海藻产物对刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群和免疫相关因子的影响[D];中国海洋大学;2010年
6 景毅;条斑星鲽(Verasper moseri)卵巢细胞系的建立及几种内分泌干扰物对其生殖与遗传毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
7 徐晓辉;两种星鲽组织细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
8 赵霞;不同养殖密度对两种鲆鲽鱼类生长及免疫指标的影响[D];中国海洋大学;2010年
9 柯可;多环芳烃—蒽对紫贻贝(Mytilus galloprpvincialis)生理生化效应的研究[D];中国海洋大学;2010年
10 蔡玉勇;应用急性病毒性坏死病毒(AVNV)分子检测技术对其主要宿主的检测与分析[D];中国海洋大学;2010年
【同被引文献】
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1 袁一鸣;汪桂玲;李家乐;;三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析[J];动物学杂志;2009年05期
2 邓雪柯;殷建华;曹毅;;3种5’RACE技术的比较与优化[J];成都医学院学报;2007年01期
3 刘卫东;赫崇波;刘彤;鲍相渤;虞星炬;;虾夷扇贝肌动蛋白基因cDNA序列克隆与分析[J];水产科学;2008年10期
4 李伟;刘功银;罗春桃;;黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析[J];水产科学;2009年08期
5 徐海圣,徐步进;甲壳动物细胞及体液免疫机理的研究进展[J];大连水产学院学报;2001年01期
6 姚翠鸾;王志勇;相建海;;甲壳动物血细胞及其在免疫防御中的功能[J];动物学研究;2006年05期
7 邓思平;陈松林;刘本伟;徐建勇;田永胜;;半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析[J];动物学研究;2008年01期
8 唐仁生;夏建红;王玉梅;喻达辉;龚世园;;大珠母贝(Pinctada maxima)金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析[J];福建水产;2009年01期
9 谷文萍;热休克蛋白70研究进展[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;1999年02期
10 王国良;金珊;陈寅儿;李政;;三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究[J];海洋科学进展;2006年04期
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1 本报记者 廖洋;[N];科学时报;2010年
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1 吴成龙;皱纹盘鲍抗氧化基因的克隆及其在营养调控下表达的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 曲凌云;三种养殖扇贝热休克蛋白HSP70在逆境因子下的表达和相关基因的克隆[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2004年
3 马洪明;栉孔扇贝血细胞形态学研究和抗病功能基因的克隆[D];中国海洋大学;2004年
4 柳峰松;中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗菌因子及模式识别蛋白的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2005年
5 胡晓丽;高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达影响的分析及相关基因的克隆与表达[D];中国海洋大学;2005年
6 朱玲;扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2006年
7 赵建民;扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2006年
8 杜欣军;中国明对虾先天免疫的模式识别与效应分子[D];山东大学;2007年
9 倪多娇;栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
10 李成华;栉孔扇贝核心组蛋白的基因结构及H2A抗菌活性的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
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1 胥炜;海湾扇贝和栉孔扇贝EST分析及C型凝集素基因的克隆与分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2004年
2 邹慧斌;栉孔扇贝和海湾扇贝G型溶菌酶基因及栉孔扇贝硒结合蛋白基因的克隆和表达研究[D];中国海洋大学;2005年
3 刘维青;海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究[D];中国海洋大学;2005年
4 孔鹏飞;海湾扇贝补体样成分AiC1qDC-1基因克隆及其功能的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2010年
【二级引证文献】
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1 康亚兰;裴瑾;蔡文龙;刘薇;罗静;吴清华;;药用植物黄酮类化合物代谢合成途径及相关功能基因的研究进展[J];中草药;2014年09期
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1 赵红艳;马氏珠母贝数量性状与微卫星的关联分析[D];广东海洋大学;2013年
2 周小龙;泥蚶微卫星分子标记的开发与应用及生长相关基因HDAC1的克隆[D];上海海洋大学;2013年
【二级参考文献】
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3 连姗姗;胡晓丽;张玲玲;包振民;;栉孔扇贝抗性选种相关生理指标的测定[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
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5 冯政夫;栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、表达及功能分析[D];中国海洋大学;2010年
6 刘晓玲;栉孔扇贝Cf-foxl2基因的克隆、表达模式及功能初探[D];中国海洋大学;2012年
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1 王斌;γ-氨基丁酸对栉孔扇贝免疫防御的影响[D];鲁东大学;2012年
2 郭颖;栉孔扇贝脑啡肽及其受体介导的神经内分泌免疫调节[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2013年
3 田双梅;苯并[α]芘对栉孔扇贝生殖内分泌干扰机制的研究[D];中国海洋大学;2013年
4 邸炜鹏;氨海水与5-羟色胺对栉孔扇贝解剖卵体外促熟作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
5 赵美丽;栉孔扇贝对石油烃蓄积及响应的初步研究[D];国家海洋局第一海洋研究所;2011年
6 秦贞奎;栉孔扇贝(Chlamys farreri)性别分化相关基因的筛选以及两个相关基因的表达分析[D];中国海洋大学;2011年
7 吴田田;栉孔扇贝(Chlamys farreri)甲腺原氨酸脱碘酶基因的克隆与功能的初步研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2012年
8 沈建平;栉孔扇贝三倍体的诱导及精子形态的研究[D];中国海洋大学;2013年
9 王丹;栉孔扇贝(Chlamys farreri)三个性腺发育相关基因的克隆及表达分析[D];中国海洋大学;2013年
10 张冬冬;因子胁迫对栉孔扇贝(Chlamys farreri)血细胞免疫响应的影响[D];中国海洋大学;2013年
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