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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2006年
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皱纹盘鲍热休克蛋白70基因的克隆、表达及应用

程培周  
【摘要】:热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员,它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能,它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。采用RACE方法从皱纹盘鲍中克隆到一种HSP70基因的全长cDNA序列,该序列与其它物种的HSP70基因高度同源。克隆得到的皱纹盘鲍HSP70基因的全长cDNA序列为2631bp,开放阅读框为1968bp,另外其5'-和3'-非翻译区长度分别是90和573bp,其中3'-非翻译区具有AATAAA mRNA加尾信号及PolyA寡聚腺苷酸。开放阅读框编码655个氨基酸,包含N端包含的382个氨基酸的ATP酶结合域(约45kDa)、由161个氨基酸编码的底物肽结合结构域(18kDa)及112个氨基酸编码的C端结构域(10kDa)。构建了含有皱纹盘鲍HSP70的表达载体,以期得到体外表达的重组热激蛋白70,为制备抗体,通过Western blot杂交或酶联免疫等方法检测HSPs蛋白表达情况作准备。 为了研究皱纹盘鲍HSP70的转录表达,采用半定量RT-PCR方法,对HSP70不同组织及热休克、鳗弧菌感染下的转录表达情况分析。试验结果表明,采用热应激及鳗弧菌处理皱纹盘鲍,均能导致皱纹盘鲍肌肉中HSP70 mRNA转录水平明显增加,并在处理后96 h恢复至正常水平;与肌肉组织不同的是,鳃组织在温度及鳗弧菌处理后12 h后达到最高值,并一直维持相对较高的表达水平。在温度和鳗弧菌处理下,皱纹盘鲍HSP70上调表达表明HSP70的响应没有胁迫特异性,可能参与了皱纹盘鲍的免疫反应。 以皱纹盘鲍近交和杂交群体为材料,研究了不同群体的生长速率和HSP70的表达量的差异。试验结果表明,在较低的处理温度下,皱纹盘鲍近交群体HSP70的表达量高于杂交群体,随着处理温度的升高,在接近致死温度时,杂交群体的HSP70表达量要高于近交群体;不同群体达到最大HSP70表达量时的温度(T_(peak))也不同,近交群体的Tpeak为26℃,低于杂交群体(28℃);近交群体的最大HSP70表达量高于杂交群体。以上试验结果表明杂交群体的HSP70的表达变化幅度较近交群体的变化幅度小,具有更宽的温度适应性。可能提供了关于杂交能够缓解皱纹盘鲍内在遗传压力的证据。 用荧光定量PCR方法分析不同壳色皱纹盘鲍在热激胁迫下不同恢复时间和
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