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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2007年
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SNAP-23蛋白在鲈鱼巨噬细胞白细胞介素1β分泌过程中的功能

陈魁  
【摘要】: SNARE蛋白家族是所有真核细胞胞吐及分泌作用中的关键因子,由其介导的运输囊泡膜与靶膜的锚靠、融合为胞内蛋白的运出提供了一条重要途径。体外试验表明,Syntaxin6-Syntaxin7-Vti1b,SNAP-23-Syntaxin4等SNARE核心蛋白之间精确的相互作用是哺乳动物巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)运输和分泌的必备条件,在机体非特异性免疫应答反应过程中起重要作用。 本研究受上述启示,旨在揭示SNARE蛋白在海洋鱼类免疫细胞内重要细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)的分泌过程中的作用。参照Percoll密度梯度离心技术,从鲈鱼头肾组织分离纯化巨噬细胞进行稳定培养;利用RT-PCR方法克隆出鲈鱼t-SNARE蛋白SNAP-23和Syntaxin3的部分cDNA序列,再结合先前克隆的VAMP2和已知的鲈鱼IL-1β,TNF-α和IL-8的基因序列,设计特异性引物。利用Real-time PCR技术在mRNA水平上精确测定鲈鱼巨噬细胞中上述6种基因在革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)分子刺激下的表达变化,发现SNAP-23基因与三种细胞因子基因的表达正相关;通过免疫印迹检测SNAP-23蛋白表达变化,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β的分泌水平,在蛋白水平上验证了SNAP-23表达与IL-1β分泌的正相关性;利用5`RACE和3`RACE技术克隆出鲈鱼SNAP-23全长基因,结合定点突变策略和靶向PCR克隆手段,构建鲈鱼SNAP-23野生型融合质粒pEGFP-SNAP-23wt,Cys缺失突变融合质粒pEGFP-SNAP-23ΔCys和模拟E型肉毒神经毒素(BoNT/E)切割突变融合质粒pEGFP-SNAP-23ΔBoNT/E,以及鲈鱼IL-1β野生型融合表达质粒IL-1β-pEGFP和IL-1β-pEYFP。所有融合蛋白均在鲈鱼巨噬细胞内成功表达,结合ELISA实验结果发现,SNAP-23野生型的表达对IL-1β的分泌有促进作用,而Cys缺失突变体的表达则抑制IL-1β向胞外分泌。首次证实了鱼类巨噬细胞内SNAP-23蛋白在IL-1β分泌过程中的重要作用。此外通过与GFP共表达,定位了IL-1β分子在巨噬细胞内的分布,发现新合成的IL-1β分子很可能像TNFα一样经“内质网-胞质-伪足-胞外”的分泌路径运出胞外。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q954.6

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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9 余莹;溃结宁膏穴位敷贴治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的临床观察及对血清IL-4的影响[D];湖南中医药大学;2010年
10 陈昌飞;溃结宁膏穴位敷贴治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的临床观察及对血清IFN-r 含量的影响[D];湖南中医药大学;2010年
【同被引文献】
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2 张盈华,殷缨,张莉,郝晓柯,张利朝,邹爱民,陶秦渝;流式细胞仪测定巨噬细胞吞噬率方法的建立及其应用[J];第四军医大学学报;2002年17期
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10 叶寒青,陈松林,沙珍霞;不同因子对花鲈胚胎干细胞增殖的影响[J];水产学报;2004年05期
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【二级参考文献】
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6 武多娇;炎症细胞在自发性高血压大鼠心肌纤维化中的作用及苯那普利的干预研究[D];福建医科大学;2005年
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9 杨维娜;子宫内膜异位症中单核—巨噬细胞分泌白介素-1α、β和干扰素-γ水平的研究[D];天津医科大学;2006年
10 李永军;糖基化终产物对巨噬细胞MMP-9表达与活性的影响及其机制的初步研究[D];中国医科大学;2006年
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