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基于凝胶电泳的中国明对虾血浆蛋白质组学研究

黄冰心  
【摘要】: 人类基因组全序列测定的完成,标志着一个崭新的时代—后基因组时代的来临。生命科学从大规模的基因组序列分析转向对基因功能的研究,蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的热点领域。蛋白质组学是以细胞、组织或体液内蛋白质的存在及其活动方式为研究对象,研究其结构、功能、相互作用和修饰。 血浆是血淋巴的重要的组成成分,具有重要的生理功能。当虾类发生病理损害时可引起血浆蛋白发生质和量的改变,分析这种特征性的变化对虾病防治具有十分重要的意义。血浆同时又是一个复杂和动态变化的系统,含有种类繁多、丰度各异的蛋白质,给研究工作带来了困难。蛋白质组学技术的不断丰富和发展,为全面而系统地认识健康和病害状态下血浆蛋白的性质提供了有利的平台。 本论文以中国明对虾为研究对象,以凝胶电泳/液质联用方法为技术平台,探索血浆蛋白质组学研究的方法。 本文首先综述了蛋白质组学的进展,包括蛋白质组学研究中的关键技术双向电泳、生物质谱以及生物信息学的进展和现状,概述了对虾类基因组、蛋白质组研究进展,提出了本课题工作的研究方向。 其次研究了中国明对虾血浆蛋白样品制备方法并获得理想的蛋白质表达图谱;确定了液质联用方法分离鉴定蛋白质的多肽洗脱条件;基于双向凝胶电泳/串联质谱策略,鉴定了中国明对虾20个血浆蛋白;验证了液相色谱/串联质谱分析复杂蛋白质混合物的鉴定技术,基于一维凝胶电泳预分离/串联质谱策略,分离鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质。 (1)优化了双向电泳的实验条件,分析了中国明对虾血浆蛋白双向电泳蛋白质表达图谱,进行了多次重复实验,取得良好的实验结果。 (2)确定了液质联用方法分离鉴定蛋白质组的多肽洗脱条件。利用血管紧张素,应用液相色谱和电喷雾离子阱质谱联用的方法,确定了适宜的多肽色谱洗脱条件,用牛血清白蛋白酶切后产生的多肽混合物对洗脱条件进行进一步验证,并确定了液质联用方法的灵敏度,应用液质联用方法鉴定牛血清白蛋白灵敏度可以达到50 fmol。 (3)利用双向电泳技术/串联质谱分析了中国明对虾血浆蛋白质,通过生物信息学分析,分离鉴定了20个中国明对虾血浆蛋白质,这些蛋白质可能通过不同途径参与了对虾生理过程并发挥着不同的功能。 (4)验证了液相色谱串联质谱联合的复杂蛋白质混合物鉴定技术。将几种蛋白质的混合物变性后直接在溶液中酶解,利用高效液相色谱—离子阱串级质谱进行序列分析,结合数据库搜索实现了混合蛋白质快速准确的鉴定。基于一维凝胶电泳预分离/串联质谱策略,分离鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质。运用生物信息学手段,对鉴定的蛋白进行功能分类,包括转录、细胞结构和骨架、信号转导、蛋白质合成与处理、蛋白质折叠分拣和降解、免疫功能、生长和发育、能量代谢、细胞周期、碳水化合物代谢、钙离子平衡、抗氧化剂、氨基酸和脂类代谢等。 最后利用Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析技术对中国明对虾血蓝蛋白进行了纯化。实验结果表明所获得的血蓝蛋白纯化样品,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为两条带,双向电泳对纯化蛋白进一步分析表明中国明对虾血蓝蛋白有三种不同的亚基组成,利用质谱对该三种亚基分别进行了鉴定。通过质谱鉴定证明本文所得纯化样品确为血蓝蛋白。为进一步研究对虾血蓝蛋白的结构和功能奠定了基础。


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