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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2009年
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皱纹盘鲍基因组单核苷酸多态标记开发与应用

亓海刚  
【摘要】: 本研究利用皱纹盘鲍的EST序列进行单核苷酸多态(SNP)标记开发;对等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法进行了优化,使之适合SNP基因型分析;对一个作图家系开发基因相关SNP标记,并对标记在子代个体中的分离情况进行了分析,探讨了借助SNP在遗传连锁图谱上定位功能基因的方法。 对大约5800条EST序列进行拼接,共获得含有4条以上序列的contig 150个,在86个含有单碱基突变位点的contigs中发现SNP 302个,碱基置换类型A/G(C/T)、A/C(G/T)、A/T、C/G的位点数目分别为147、90、21、16个。50个contigs在BLASTx分析后具有匹配(E值小于1E-5),其中的220个SNPs全部为同义cSNPs,位于遗传密码子的第三简并位。粗略估算,皱纹盘鲍核基因组中SNP的平均分布密度不低于1%。 通过扩增DNA pool后产物直接测序共验证了28个SNP。PCR直接测序法操作简单,结果可靠,一次测序可能验证多个位点,有时还可以发现新的突变位点。通过重点研究引物3’端不同错配对PCR扩增的影响,对AS-PCR的引物设计原则及反应条件进行了探讨及优化,发现在AS引物的3’端倒数第二位引入额外的强错配后,AS-PCR检测SNP的特异性会得到很大的提高,从而使AS-PCR可以满足小规模的SNP基因型分析。 根据EST-contig或者单一的EST序列设计PCR引物74组,其中43组可以特异扩增皱纹盘鲍基因组DNA。用这些引物扩增一个作图家系的父母本,并对PCR产物纯化后分别进行双向直接测序,在18个基因片段中发现了86个SNP,其中82个是新SNP,并且绝大多数SNP位于内含子序列中。这些SNP在父母本中的基因型,在多数情形下,是一方为纯合(AA),而另一方为杂合(AB);父母本均为杂合和均为纯合的形式则较少。在父母本中杂合形式的SNP位点,理论上可以在子代中发生分离。 在每个基因的内含子中选择父母本基因型为AA×AB或者AB×AA的SNP位点,设计AS-PCR分型引物并检测123个子代个体的基因型。在对9个基因中的11个SNP位点(包括5个母本标记和6个父本标记)进行子代基因型分析后发现,2个位点不符合孟德尔1:1分离(P 0.05),符合预期分离比率的9个位点存在较大可能定位于遗传连锁图谱。通过分析两组父母本标记(F142和M142,F459和M459)发现,在根据父母本序列设计SNP分型引物时,可以设计指向同一基因的成对的父母本标记,从而使两个单亲标记可作为一个共同标记使用。
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