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《中国科学院研究生院(海洋研究所)》 2009年
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弧菌琼胶酶和丝氨酸蛋白酶的筛选、分析以及免疫应用

张卫卫  
【摘要】: 从山东黄岛海水养殖场分离到一株弧菌V134,从中克隆得到琼胶酶基因agaV,并将其在大肠杆菌中表达,纯化得到重组的琼胶酶AgaV。酶活分析发现该琼胶酶的最适温度在40℃左右,对pH比较敏感,pH 7.0时具有最高的琼胶裂解活性。对AgaV进行了两种应用性探索:(1)利用AgaV从琼脂糖凝胶中回收DNA,回收效率可达90%以上;(2)利用agaV作为报告基因构建了捕获分泌序列的载体pBU,并用其从革兰氏阳性细菌(G+菌)和革兰氏阴性细菌(G-菌)中筛选出了一系列分泌蛋白。将利用pBU从一株哈维氏弧菌T4中筛选出的6个分泌蛋白分别进行基因克隆、蛋白表达纯化和牙鲆免疫实验,发现其中一个蛋白,命名为DegQ_(Vh),具有免疫保护效应,其免疫保护率(RPS)可达64%。为了提高DegQ_(Vh)的免疫保护效应,将AgaV的分泌结构域与DegQ_(Vh)融合,构成融合抗原AgaV-DegQ_(Vh)。利用大肠杆菌作为载体菌构建了AgaV-DegQ_(Vh)融合抗原递呈系统,用其作为疫苗进行免疫,发现其RPS可达到95%。酶活分析表明DegQ_(Vh)在50℃、pH 8.0时具有最高的活性。突变分析表明83位的组氨酸、113位的天冬氨酸和188位的丝氨酸以及两个PDZ结构域是DegQ_(Vh)活性所必需的。表达分析发现degQ_(Vh)表达受温度和细胞浓度调控,并且其上游有一个受σE调控的启动子。进一步的分析发现DegQ_(Vh)能够与大肠杆菌的DegP功能互补。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S917.1

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