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中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)TOR基因的分子克隆及相关信号通路的初步研究

孙姝娟  
【摘要】: 本文以我国重要养殖经济动物中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象,对其细胞生长和营养调控相关的TOR(Target of Rapamycin)信号转导通路进行了初步的研究。利用同源克隆和RACE技术首次从中国明对虾中克隆得到完整的TOR基因,cDNA全长7638bp,开放阅读框7389bp,编码2462个氨基酸。氨基酸序列比对和结构域分析均证实其为目前已知的TOR激酶的同源蛋白。应用real-time PCR分析TOR在中国明对虾中的组织分布特异性,结果显示TOR在肌肉组织中表达量最高,在血细胞中表达量最低。通过分析注射亮氨酸、精氨酸和TOR特异性抑制剂雷帕霉素后TOR基因表达水平的变化和TOR信号通路中蛋白因子磷酸化水平的变化,研究了TOR信号通路的生长调控功能。利用Real-time PCR分析注射亮氨酸和精氨酸后肌肉组织TOR mRNA含量的变化,结果显示TOR基因的表达在注射亮氨酸和精氨酸后24h内出现显著升高。利用Western blot检测肌肉组织TOR信号通路相关蛋白质磷酸化水平的变化,结果显示注射亮氨酸和精氨酸后30min,TOR和p70S6K1蛋白磷酸化水平会明显增高,1h后逐渐恢复正常水平。这些结果表明亮氨酸和精氨酸能够上调TOR基因的表达并激活TOR信号转导通路,并且TOR基因转录的变化滞后于蛋白磷酸化水平的变化。Western blot的结果还显示,注射雷帕霉素后,TOR和p70S6K1蛋白的磷酸化水平在30min后明显降低,2h后可以恢复到正常水平,表明雷帕霉素能够抑制中国明对虾TOR激酶的活性,阻断依赖TOR信号通路的磷酸化反应的发生。


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