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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2002年
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端粒酶活性与肝癌细胞生长的控制

张如刚  
【摘要】: 本文的目的在于探讨控制人肝癌细胞端粒酶活性的可能性及其肿瘤生物学意义。研究结果表明端粒酶RNA组分模板区的反义寡核苷酸和端粒酶反转录酶样组分的功能域基因突变体可能是人肝癌细胞端粒酶活性和肝癌细胞生长的有效控制手段,本文还探讨了以端粒酶活性作为抗肝癌新药筛选靶点的实验室根据。 为完成本项研究,在通用的放射性端粒酶活性定性检测方法的基础上,作者在国际上首先建立了一种端粒酶活性定量测定方法,这种无放射性的方法与以前通用的放射性定性法相比,最大的优点在于能精确定量,还避免了放射性对环境的污染和对工作人员的伤害。就是同最近国外新建立的放射性定量法相比,本方法也并不逊色,不但同样灵敏,可重复性和准确性还更好一些。 作者用该方法检测了正常人肝组织及4种人肝癌细胞株(BEL-7404, SMMC-7721, QGY-7903和HCCM)的端粒酶活性,发现正常人肝组织的端粒酶活性为阴性,而4种人肝癌细胞株的端粒酶活性则均为阳性,该结果提示端粒酶活性是肝癌诊断、治疗和预防的一个新的切入点。 端粒酶RNA组分模板区的反义寡核苷酸可以有效抑制BEL-7404人肝癌细胞的端粒酶活性,而正义和错义寡聚物则对端粒酶活性几乎没有影响。5μmol/L的端粒酶RNA组分模板区的反义寡核苷酸作用BEL-7404人肝癌细胞96 小时后,细胞明显萎缩、形态不规则、核固缩、悬浮细胞增多、部分细胞死亡。用原位末端标记法(TUNEL)所做的观察证明细胞已发生凋亡,流式细胞仪分析表明凋亡可达到42.58%,周期阻滞主要发生在G2/M期。这些结果证明端粒酶RNA组分模 WP=3 板区的反义寡核苷酸可以有效抑制BEL-7404人肝癌细胞的端粒酶活性,导致细胞周期阻滞和凋亡。 作者证明端粒酶的反转录酶样组分(telomerase reverse transcriptase subunit)对肝癌细胞的生长同样是必需的。其事实为:表达端粒酶反转录酶样组分的功能域基因突变体(dominant-negative form of human telomerase reverse transcriptase, DN-hTERT)可以有效抑制BEL-7404人肝癌细胞的端粒酶活性,端粒的长度会随着细胞分裂逐渐缩短,生长受到抑制,其程度与端粒酶活性的抑制水平相平行,在多次传代后,转染DN-hTERT的细胞膨胀变大,当端粒缩到极限短时(大约1.7Kb),细胞发生凋亡;作者还首次证明DN-hTERT表达细胞在裸鼠体内的成瘤性丧失。 作者对4种肝癌的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(DOX)、顺铂(CDDP)和丝裂霉素(MMC)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响进行了研究,发现作用浓度为各自的IC50值时,只有 DOX和CDDP才能抑制BEL-7404人肝癌细胞的端粒酶活性,其抑制率呈现浓度和时间依赖性,端粒长度也相应缩短,但端粒酶的三个组分的mRNA[反转录酶样组分、RNA组分和端粒酶相关蛋白1组分]的表达在此过程中均没有变化,而5-Fu和MMC 则对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性没有影响。作者还发现DOX和CDDP使肝癌细胞的周期阻滞在G2/M期,细胞凋亡的比例在此过程中似无明显变化。这些结果表明,至少一部分肝癌的化疗药物有抑制端粒酶活性的机制参与,提示端粒酶活性的抑制有可能用来筛选治疗肝癌的新药
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R735.7

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