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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2003年
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破骨细胞形成抑制因子OPG、蝎毒素BmK ITa1的基因克隆、表达及其功能研究

刘珍  
【摘要】: 本论文利用RT-PCR和RACE技术克隆了OPG和BmK ITa1两个基因, 并分别对其进行了表达及功能研究。 第一部分,OPG及其突变体OPG-280、OPG-Fc的构建、表达及功能研究。 破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF 或称 osteoprotegerin, OPG) 是1997年发现的具有降血钙作用和防止骨质流失的一种新的可以调节骨密度的糖蛋白质。OPG作为一种新发现的蛋白质,具有很高的研究意义和开发价值。目前用于结构与功能研究的OPG主要通过CHO细胞表达重组蛋白, 但其较低的表达量限制了研究进程。所以我们的目标就是利用基因工程手段构建一系列OPG突变体,同时完成将它们在不同的表达系统中进行重组表达的研究以建立一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。 成熟的OPG共有380个氨基酸,存在着单体和二聚体两种形式,其中Cys379对OPG形成同源二聚体是必需的。之前,我们利用RT-PCR技术首次从中国人正常肝细胞株L02中克隆到一种新的破骨细胞形成抑制因子变体基因(OPG-372) (GenBank登录号AF134187), 序列分析结果表明,与国外文献报道相比较,中国人肝细胞株和胎盘中该cDNA 3'端存在一个赭石型终止码突变,从而使这一个蛋白比报道的在C端少8个氨基酸残基。 OPG-372基因已在昆虫杆状病毒表达系统表达并证明OPG-372没有形成二聚体。 为了构建OPG一系列突变体,进一步比较重组OPG单体与同源二聚体的体内代谢及其生物效应稳定性, 我们接着从中国人外周血淋巴细胞(PBL)中克隆了OPG基因3’端基因组序列210bp,与国外文献报道的OPG cDNA3'序列相一致,将此210bp与OPG-372重组拼接得到全长无缺失的OPG。 同时,考虑到人免疫球蛋白IgG Fc片段的多个二硫键可能有助于OPG形成同源二聚体, 我们在OPG-372 C端融合Fc得到加长突变体OPG-Fc。 另外,为了调查重组OPG最小的功能片段,结合其结构特点,我们去除OPG-372 C端的100个氨基酸,得到缩短突变体OPG-280。 WP=3 之后,本论文首次成功地将OPG及其变体OPG-280和OPG-Fc基因克隆于表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中进行融合表达。研究结果表明经1mmol/L IPTG诱导5h后,OPG-280得到高效表达,产物主要为不溶性包涵体,OPG, OPG-Fc 仅有少量表达。将OPG-280 经Ni2+-IDA柱纯化,变复性,OPG-280的6×His 融合蛋白在3h后可以降低小鼠血钙浓度1.5 mg/100ml, 即下降15%左右。然而,OPG和OPG-Fc在大肠杆菌中的重组表达量太低, Ni2+-IDA柱亲和层析纯化后表达产物很少,而且需要对表达产物进行变复性,不足进行动物实验。所以我们在其他表达系统如昆虫表达体系进行OPG进一步研究。 进而,将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因分别插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBac1和pFastBacHTb中, 成功地将OPG、OPG-280、OPG-Fc三种基因在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中得到高效表达,而且OPG-Fc在Tn细胞中形成同源二聚体。经小鼠降血钙实验发现,六种表达产物OPG 、OPG-280、OPG-Fc 、His-OPG 、His-OPG-280、 His-OPG-Fc均有生物活性,它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为10%,11%,15%,8%,10%,14%。 同时,我们首次将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8 中,并将它们在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)-家蚕( Bombyx mori)表达系统中进行了高效表达,通过非还原SDS-PAGE 发现OPG和OPG-Fc均能形成同源二聚体,而且表达的OPG蛋白出现糖基化。通过小鼠降血钙的实验,证明了三种重组表达产物OPG、OPG-280、OPG-Fc均有良好的生物活性,它们3h后可以降低小鼠血钙浓度分别为19%,14%,17%。 在以上三个表达系统中,C端缺失100个氨基酸的OPG-280仅以单体方式存在, OPG仅在昆虫虫体中可以形成二聚体,C端融合人免疫球蛋白Fc片段的OPG-Fc在大肠杆菌中没有形成同源二聚体,而在Tn细胞和家蚕虫体内均存在单体和同源二聚体两种形式,推测Fc自身的多个二硫键有助于OPG同源二聚体的形成。从小鼠降血钙实验分析,在昆虫细胞产物中,OPG-Fc活性最高,在昆虫虫体中,OPG和OPG-Fc活性相当,说明在虫体中都能很好形成稳定双体,活力略高于单体,而C端缺失100个氨基酸对其生物学活性没有明显影响。这为开发重组表达OPG的家蚕口服药物在临床上治疗高血钙症以及骨质疏松症等疾病创造了条件。 第二部分,蝎毒素基因BmK ITa1的克隆、表达及其重组蛋白酰胺化后加工 WP=4 的研究。 根据东亚钳蝎中的抑制型昆虫毒素的N端序列,戚正武先生实验室利用cDNA末端序列快速扩增技术 (RACE) 从蝎尾腺总RNA中克隆到多个昆虫毒素cDNA,我们从中得到一个BmK ITa1 cDNA,经测序证明它是抑制型昆虫型毒素。它的结构与已知的抑制型昆虫型毒素很相似:cDNA 编码一段21个残基的信号肽,一段61个残基的成熟肽和C末端三个额外的残基,而且序列也很同源。在BmK ITa1 cDNA 的成熟肽编码区后有GKK 三个残基,这说明BmK ITa1 的基因产物C末端是酰胺化的。(GenBank登录号AY090782) 接着,我们将BmK ITa1基因克隆至装有融合蛋白DsbC的表达载体pET-40b中,得到融合基因DsbC-BmK ITa1在大肠杆菌中重组表达。经1mM的IPTG诱导表达3小时,超声破菌后表达产物约占细菌蛋白质总量
【关键词】:破骨细胞形成抑制因子OPG;蝎毒素BmK IT1;克隆;突变体;重组表达;大肠杆菌;昆虫杆状病毒表达系统;家蚕;降血钙作用;酰胺化后加工;杀虫效应
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785
【目录】:
  • 第一部分 OPG及其突变体OPG-280、OPG-Fc的构建、表达及功能研究2-71
  • 第一章 破骨细胞形成抑制因子研究进展12-26
  • 第二章 破骨细胞形成抑制因子(OPG)基因的克隆及其突变体基因构建-26-38
  • 中文摘要26-27
  • 材料与方法27-28
  • 结果28-35
  • 讨论35-36
  • 参考文献36-37
  • 英文摘要37-38
  • 第三章 OPG及其突变体基因在E.coli中的表达及生物活性测定38-47
  • 摘要38-39
  • 材料与方法39-40
  • 结果40-44
  • 讨论44-45
  • 参考文献45-46
  • 英文摘要46-47
  • 第四章 OPG及其变体基因在昆虫细胞中的表达及活性测定47-58
  • 摘要47-48
  • 材料与方法48-50
  • 结果50-55
  • 讨论55-56
  • 参考文献56-57
  • 英文摘要57-58
  • 第五章 OPG及其变体基因在家蚕幼虫中的表达及活性测定58-71
  • 摘要58-59
  • 材料与方法59-61
  • 结果61-66
  • 讨论66-69
  • 参考文献69-70
  • 英文摘要70-71
  • 第二部分 蝎毒素基因BmKITa1的克隆、表达及其重组蛋白酰胺化后加工的研究71-119
  • 第六章 BmKITa1的克隆及序列分析72-85
  • 摘要72-73
  • 材料与方法73-76
  • 结果76-79
  • 讨论79-81
  • 参考文献81-84
  • 英文摘要84-85
  • 第七章 BmKITa1基因在E.coli中的表达及生物活性测定85-96
  • 摘要85-86
  • 材料与方法86-87
  • 结果与讨论87-93
  • 参考文献93-95
  • 英文摘要95-96
  • 第八章 BmKITa1基因在昆虫细胞中的表达及生物活性测定96-109
  • 摘要96-97
  • 材料与方法97-99
  • 结果99-104
  • 讨论104-106
  • 参考文献106-108
  • 英文摘要108-109
  • 第九章 BmKITa1基因在家蚕体内的表达109-119
  • 摘要109-110
  • 材料与方法110-112
  • 结果112-115
  • 讨论115-116
  • 参考文献116-118
  • 英文摘要118-119
  • 文章目录119-120
  • 致谢120

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 林蓉,李霁,张耀洲,吴祥甫;用蚕表达丙型肝炎抗原制备口服药物效果的研究[J];蚕桑通报;1998年02期
2 杨宇虹,陈虎,俞超,曾嵘,崔大敷,吴祥甫,李伯良;基因工程表达产物的体外酰胺化加工[J];生物化学与生物物理学报;2000年03期
3 熊玉梅,凌敏华,赵彤,王大成,戚正武;两个东亚钳蝎抗哺乳动物神经毒素的cDNA序列[J];生物化学与生物物理学报;1997年02期
4 江智红,杨宇虹,徐来根,杨新颖,夏其昌,李伯良,王德宝;大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活性表达及在体外酰胺化修饰中的应用[J];生物工程学报;1998年02期
5 钱德明,沈根全,柯若伦;用大鼠血钙法测定降钙素生物效价的探讨[J];药物分析杂志;1994年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张锐;蚕桑副产物与人体免疫[J];蚕桑通报;2000年01期
2 田军,王瑞冬,鲍燕燕;口服降钙素肠溶微粒的制备及其降血钙作用的实验研究[J];第二军医大学学报;2001年12期
3 郑肇广;口服降钙素肠溶微粒的制备及实验研究[J];国际医药卫生导报;2004年14期
4 聂东宋,梁宋平,李敏;动物肽类神经毒素基因工程研究进展[J];湖南师范大学自然科学学报;2001年01期
5 何小林,刘新奇,曾宗浩,李宏民,王淼,张英,王大成;马氏钳蝎中性神经毒素BmK M4 0.20nm晶体结构测定[J];中国科学C辑:生命科学;2000年01期
6 王昕,石晶,李建桥,任露泉;蚕蛹蛋白饮料的研制[J];吉林工业大学学报(工学版);2002年04期
7 戴光荣,施秉银;重组降钙素研究进展[J];医学研究生学报;2005年10期
8 郑莉,赵明,王会信;人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达[J];军事医学科学院院刊;1998年01期
9 时连根,徐俊良;家蚕作为生物反应器新用途的开发研究[J];科技通报;2000年03期
10 朱顺义,曾宪春,李文鑫,蒋达和;一个东亚钳蝎K~+通道阻断剂cDNA的克隆和序列分析[J];科学通报;1999年21期
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1 王晓娟;谢敏;张星;曹广力;薛仁宇;虞晓华;贡成良;;转BmKIT3~R基因对家蚕发育的影响[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 杨瑞丽;家蚕/BmNPV表达载体系统高效表达人乙肝表面抗原(PreS2+S)及表达产物免疫原性的研究[D];浙江大学;2002年
2 沈东海;蝎毒抗癌成分的分离纯化及其在大肠杆菌中表达的实验研究[D];第二军医大学;2003年
3 王胜朝;人CD14基因重组、真核表达及其在牙髓、牙龈炎中作用的实验研究[D];第四军医大学;2000年
4 孙平楠;酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究[D];中国海洋大学;2007年
5 姜勇;鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价[D];中国海洋大学;2008年
6 王婉灵;重组克胰素的基因工程表达及药效学研究[D];中南大学;2009年
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1 梁利恒;重组sCT-CGRP基因转生菜体系的建立及表达的研究[D];黑龙江大学;2011年
2 邓洪斌;蝎抗神经兴奋活性组分制备工艺及其部分性质研究[D];沈阳药科大学;2001年
3 聂东宋;虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)在巴氏比赤酵母中的表达[D];湖南师范大学;2002年
4 朱一望;霍乱毒素B亚基乙肝表面抗原中蛋白融合基因在家蚕核型多角体病毒载体系统中的表达研究[D];浙江大学;2004年
5 王丽霞;“功能性肽-Fe”的抗贫血保健功能研究[D];天津科技大学;2005年
6 葛鑫;人降钙素的克隆与表达[D];沈阳药科大学;2006年
7 王昌河;不同方法脱胶蚕丝及转蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕蚕丝的力学性能研究[D];四川大学;2006年
8 杨志霞;线性鲑鱼降钙素类似物的合成及长效研究[D];河北医科大学;2007年
9 诸戌娴;家蚕丝胶基因启动子的克隆与活性分析及转基因研究[D];苏州大学;2007年
10 孟康康;鲑鱼降钙素肺部吸入粉雾剂的研究[D];沈阳药科大学;2008年
【二级参考文献】
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1 秘晓林,魏庆兰,刘新铭;丙型肝炎病毒C33_c单克隆抗体的研制和鉴定[J];微生物学免疫学进展;1996年04期
2 张伊璜;丙肝疫苗研究的新进展[J];微生物学免疫学进展;1996年04期
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1 朱顺义,李文鑫;蝎毒素基因分子生物学研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1999年04期
2 郑连爽;;蝎毒素应用研究进展[J];生命的化学;1988年05期
3 吉永华,徐科,顾梓伟;马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅰ的部分氨基酸顺序[J];科学通报;1984年19期
4 柴志芳,吉永华;利用蝎毒素分子骨架的蛋白质工程[J];生命科学;2003年05期
5 张守涛,董建军,肖乐义,郭唯,赵天增;东亚钳蝎K~+通道阻断肽cDNA的克隆与表达[J];生物技术;2004年05期
6 刘岩峰,张景海;重组蝎毒素基因表达的研究进展[J];沈阳药科大学学报;2003年01期
7 周新华;;蝎和蝎毒[J];大自然;1983年02期
8 张守涛,郭霭光,肖乐义,董建军,赵天增,薛歧庚,孔天翰,郭唯;东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2002年06期
9 周新华;;蝎毒的生化研究及临床应用[J];辽宁大学学报(自然科学版);1982年S1期
10 陈冰,吉永华;短肽蝎毒素的结构分类与功能特征[J];生物化学与生物物理进展;2001年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈学良;高芳;;蝎毒素选择性诱导非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡及其作用机制的研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
2 吉永华;;BmK AS类新型蝎毒素多肽的分子结构特征及其药理功能的研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
3 易虹;韩松;尹世金;邱溯;曹志贱;吴英亮;李文鑫;;蝎毒素与钾通道多样性相互作用及其潜在应用[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
4 刘玲;肖杭;周建伟;王春安;孙继虎;;蝎毒素对海马神经元NMDA受体的抑制作用及其机制[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
5 汤永红;刘秋庭;刘锋;周训平;周成芳;刘卓然;;血钙检测在西比灵治疗急性脑梗死的临床研究[A];中国康复医学会脑血管病专业委员会第八次全国学术研讨会论文集[C];2004年
6 叶林柏;陈海雷;郜金荣;朱应;梁东瑞;;昆虫杆状病毒与哺乳动物的相互作用[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
7 吴英亮;易虹;李文鑫;;蝎毒素与钾通道相互作用的多样性研究[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
8 胡义平;古春萍;李晓娟;刘叔文;;青藤碱抑制破骨细胞形成的作用和机制研究[A];第十届全国抗炎免疫药理学学术会议论文集[C];2010年
9 叶建国;汪丛莹;李亚军;谭智勇;严艳萍;李晨;陈瑾;吉永华;;BmK abT,一个全新的旧大陆蝎毒素的分离纯化、基因克隆和功能鉴定[A];中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会第4次、中国生物化学与分子生物学会毒素专业组第5次学术研讨会论文摘要[C];2001年
10 高峰;曹俊娜;齐伟;高革;高孟哲;刘文第;;利用不同电泳技术对蝎毒素ITX蛋白组分分离的实验研究[A];中医药生物化学与分子生物学通讯[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;纳米级氧化铁-蝎毒素肽靶向治疗神经胶质瘤的实验研究[N];中国医药报;2003年
2 李亚兰;血钙过高莫忘查肿瘤[N];中国医药报;2001年
3 山东莱阳中心医院 宋丽华;血钙高≠不缺钙[N];健康报;2008年
4 蒋家騉;查血钙判断宝宝缺钙准确吗[N];家庭医生报;2007年
5 宋丽华;血钙高未必不缺钙[N];家庭医生报;2008年
6 钱贵生;老年人血钙高不可忽视[N];医药养生保健报;2004年
7 记者 薛锁明;昔日“孔雀”无奈东南飞 如今“金蛋”仍难回故里[N];山西日报;2006年
8 本报特约记者 许艾素;血钙正常为啥还要补钙?[N];健康时报;2005年
9 记者  方华;果业:从“品质”到“品牌”[N];金融时报;2006年
10 济南市第五人民医院 李延斌;全蝎临床作用新研究[N];中国中医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘珍;破骨细胞形成抑制因子OPG、蝎毒素BmK ITa1的基因克隆、表达及其功能研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
2 赵勇;生物质谱在蝎毒素蛋白质组学中的应用及其蛋白质翻译后修饰检测研究[D];武汉大学;2011年
3 左小潘;两种新型钠通道的分子克隆与比较药理学研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
4 曹志贱;东亚钳蝎K~+通道毒素的克隆、表达及其结构与功能关系研究[D];武汉大学;2004年
5 盛继群;一种新的东亚钳蝎毒素BmTxKS4基因克隆及其功能鉴定研究[D];武汉大学;2004年
6 高芳;蝎毒素选择性诱导非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡及其作用机制的研究[D];山东大学;2009年
7 孙平楠;酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究[D];中国海洋大学;2007年
8 姜勇;鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价[D];中国海洋大学;2008年
9 张志珍;基因工程制备重组人胰高血糖素样肽-1及其生物学活性研究[D];第二军医大学;2002年
10 方庆;N-乙酰半胱氨酸、青藤碱在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解中的作用[D];第四军医大学;2011年
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1 李晓芳;基于Markov模型的昆虫杆状病毒基因组的进化研究[D];浙江理工大学;2011年
2 张中月;大黄酸对破骨细胞形成及分化的影响[D];河北医科大学;2012年
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5 刘水涛;体外冲击波对成骨细胞与破骨细胞共培养系中破骨细胞形成及活性影响的研究[D];河北医科大学;2011年
6 陆文蔚;荧光假单胞菌的分离及蝎毒基因的原核表达[D];上海师范大学;2005年
7 吕猛;东亚钳蝎毒素BmαTX14的基因组克隆、真核表达纯化及其功能的初步研究[D];武汉大学;2005年
8 张希;东亚钳蝎镇痛活性肽Ⅳ的表达及其活性研究[D];沈阳药科大学;2007年
9 栾兰;蝎毒对体外培养的人肝癌细胞(SMMC 7721)和Hela细胞株的抗肿瘤作用研究及机制探讨[D];大连医科大学;2008年
10 吴文娟;端基为胺基的树枝状大分子的合成及功能化研究[D];苏州大学;2004年
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