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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2003年
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辛纳毒蛋白细胞毒性及热稳定性研究

汪宝忠  
【摘要】: 第一部分 辛纳毒蛋白和蓖麻毒蛋白对BA/F3β 细胞毒性的比较研究 辛纳毒蛋白(cinnamomin)是本组从香樟树(Cinnamomum camphora)纯化的II型核糖体失活蛋白。以前对它的细胞毒性只做过初步研究,没有与其它双链核糖体失活蛋白进行比较。本文对辛纳毒蛋白的RNA N-糖苷酶活性及其细胞毒性进行了研究,并与蓖麻毒蛋白(ricin)进行了比较。结果表明辛纳毒蛋白的A-链与蓖麻毒蛋白的A-链对兔网织红细胞裂解液构成的蛋白质合成系统具有相近的蛋白质合成抑制作用(蛋白质合成能力被抑制一半时毒素的浓度,即半抑制剂量IC50 分别为8×10-10 M和4×10-10 M);但是,对于培养的BA/F3β细胞作的试验表明,辛纳毒蛋白的细胞毒性比蓖麻毒蛋白低得多(IC50分别为1.1×10-11 M和8×10-14 M)。为了说明细胞毒性的巨大差异是因为它们的B-链差异造成,我们纯化了辛纳毒蛋白和蓖麻毒蛋白的A-链和B-链,用二硫键交换反应制备了两个杂合蛋白,对它们的细胞毒性与两个天然毒蛋白进行了比较,结果表明辛纳毒蛋白A-链(CTA)和蓖麻毒蛋白B-链(RTB)构成的杂合蛋白(CTA-RTB)与天然蓖麻毒蛋白的细胞毒性相近;而由蓖麻毒素A-链(RTA)和辛纳毒蛋白B-链(CTB)构成的杂合蛋白(RTA-CTB)与天然辛纳毒蛋白的细胞毒性相近。这些结果说明两种毒素的B-链是天然毒素细胞毒性不同的原因。通过直接细胞ELISA,对两种毒素B-链在BA/F3β 细胞表面的结合数进行了定量。Scatchard 分析表明,两种毒素对细胞表面结合位点基本一样,它们可能共用相同的细胞膜受体,但结合常数不同。 第二部分 辛纳毒蛋白A-链热稳定性研究及其B-链介导的部分变性A-链的重折叠 纯化的辛纳毒蛋白A-链的物理稳定性要比在A-/B-链混合物中及完整辛纳毒蛋白都低,无论是在4℃下放置还是被加热处理都是这样。从圆二色谱及色氨酸荧光光谱可以看出,在45℃下加热处理20分钟,辛纳毒蛋白A-链产生部分非折叠的中间体并丧失其三级结构,RNA N-糖苷酶活性丧失,尽管仍然保持主要的二级 WP=3 结构。中间体对蛋白酶敏感,表现出熔球(molten globule)特征。停止加热处理并冷却不能使这种构像及活性上的变化恢复。进一步的实验表明辛纳毒蛋白B-链能够使这种部分解折叠的辛纳毒蛋白A-链恢复RNA N-糖苷酶活性,但是不能恢复完全解折叠的A-链的糖苷酶活性。我们认为,这可能反映了辛纳毒蛋白B-链对毒素在细胞内运输时的作用,即保持A-链的结构稳定,重折叠那些部分解折叠的A-链,并使其免于象多数其它变性蛋白被降解的命运。 第三部分 香樟树种子中“两性”超氧化物歧化酶的超螺旋DNA切割活性研究 我们从香樟树(Cinnamomum camphora)种子中首次纯化到一种"两性"超氧化物歧化酶(cambialistic superoxide dismutase,cambialistic SOD)。这种SOD在天然状态下是一个含Fe的SOD。除了已知的SOD能保护细胞免受超氧游离基侵害之外,我们发现了香樟树Fe-SOD的另一性质:能够切割超螺旋的pGEM-4Z 质粒形成缺刻或线状产物。以线性化的pGEM-4Z、线性λphage DNA 以及大肠杆菌5S rRNA作为底物进行试验时,发现香樟树SOD不能作用于这三种底物,说明酶对底物有选择性(超螺旋DNA),同时表明用于试验的酶没有核酸酶污染。进一步研究发现被DNA拓扑异构酶I松弛的闭合双链DNA也能被SOD作用产生线状产物。这说明酶在发生作用时要求底物DNA在拓扑结构上是受限的。香樟树Fe-OD的DNA切割活性能被SOD抑制剂NaN3、过氧化氢酶 或羟基游离基清除剂(甘露醇或乙醇)抑制,这说明SOD 的歧化酶活性是DNA切割活性所必须的。对酶化学修饰及热处理的结果表明两活性变化趋势一致。据此,我们认为,是SOD歧化超氧游离基产生的过氧化氢进一步在酶金属离子的作用下进行Fenton型反应,产生了高活性的羟基游离基并诱导了DNA 的断裂。重组的H2O2 和Fe3+反应体系实现了DNA的切割反应。另外,我们的试验证明,香樟树Fe-SOD 对超螺旋DNA的切割位点是随机的。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q26

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