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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2003年
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蛇毒金属蛋白酶/去整合蛋白新基因的克隆及其功能研究

王韶辉  
【摘要】: 蛇毒金属蛋白酶/去整合蛋白是蛇毒中的主要功能蛋白之一,它们是引起伤口流血不止的主要蛇毒成分。到现在为止,已有20多种蛇毒金属蛋白酶的氨基酸序列被测定,并有四种蛇毒金属蛋白酶的晶体衍射结构被测定。去整合蛋白是一类首先在蛇毒中发现的富含半胱氨酸的多肽,它具有抑制血小板聚集等多种功能,后来研究发现它和PⅡ型蛇毒金属蛋白酶属于同一前体。 我们利用RT-PCR方法从江浙蝮蛇中克隆出一个含去整合蛋白结构域的基因片段,从测定的片段序列中取出特异的序列作为引物获得它的全长基因。通过序列测定发现,它和以前报道的蛇毒金属蛋白酶序列有很高的同源性(和contortrostatin同源性为78%,和bothrostatin同源性为77%),但它是一个新的蛇毒金属蛋白酶和去整合蛋白基因,而且它的C端去整合蛋白结构域比其他的蛇毒金属蛋白酶多出两个半胱氨酸(Cys407,Cys426),我们把它命名为Agkistin以区别其他蛇毒金属蛋白酶/去整合蛋白。 为了研究Agkistin的功能,我们将含有完整去整合蛋白结构域编码区的Agkistin-s小片段(残基344-488)插入到表达质粒pET-28a(+)上,在30℃用IPTG诱导表达出可溶性蛋白,用Ni2+-IDA柱将表达蛋白纯化后得到Agkistin-s蛋白。同时我们将Agkistin和Agkistin-s基因分别插入到重组昆虫病毒表达系统(Bac-to-Bac系统)的pFastBac-Htb和pFastBac-Hta质粒上,在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞进行表达,并用Ni2+-IDA柱纯化后得到Agkistin和Agkistin-s表达蛋白。 利用Tn-5B1-4细胞和E.coli来源的重组Agkistin和Agkistin-s蛋白,我们测定了它们抑制ADP引起的血小板凝集的活性,其中Agkistin-s的抗血小板凝集的活性要强于Agkistin,同时还发现Agkistin-s蛋白在高浓度下还有轻微解聚功能。同时,利用鸡胚发育时血管生长较快的特点,我们进行了Agkistin和Agkistin-s蛋白对鸡胚自发性血管生长的影响的研究,发现两者都具有明显 WP=4 的抑制血管生长的作用,这些结果表明去整合蛋白结构域是Agkistin抑制血管生长的主要因素。 血管内皮细胞的凋亡在血管生长等生理活动中起重要作用,我们在培养的人的微血管内皮细胞系HMEC细胞培养物中加入重组Agkistin蛋白,发现它具有诱导HMEC细胞凋亡的活性,我们用流式细胞仪测定了Agkistin蛋白的诱导HMEC细胞凋亡的凋亡率,0.5μM的Agksitin蛋白能够诱导HMEC细胞产生34.07%的凋亡。此外,我们还发现E.coli来源的重组Agksitin-s蛋白对牛的大动脉血管内皮细胞BAEC的生长也具有抑制作用。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785

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