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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2005年
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叶绿体ATP合酶的活性调节与亚基的定点突变

董慧  
【摘要】:叶绿体ATP合酶是存在于高等植物类囊体膜上的四大蛋白复合体之一,由镶嵌在膜内的CF0和突出于膜外的CF1组成,是光合作用能量转换的关键酶。它能利用与光合电子传递耦联的质子转运形成的跨膜质子动力势催化光合磷酸化的末端反应,将ADP和无机磷Pi合成ATP。因此,对ATP合酶进行深入的研究在生物能力学上具有重要的意义。本论文工作主要是研究四环素对光合磷酸化作用的促进作用及其在ATP合酶上的作用部位,和通过定点突变研究合酶中具有重要功能的ε亚基的结构与功能。 1. 用四环素处理菠菜的离体叶绿体,研究它对菠菜叶绿体的光合磷酸化作用和电子传递等反应的影响。用低浓度的四环素溶液处理菠菜叶绿体, 观测到它可促进非循环和循环光合磷酸化和电子传递,因对非循环光合磷酸化促进程度比对电子传递的大,所以P/O值也升高。叶绿体毫秒延迟发光也同样得到促进,但叶绿体的Mg~(2+)-ATPase活性只稍有提高。这些结果说明菠菜叶绿体对于四环素很敏感。用四环素处理游离的CF1后,发现CF1的Mg~(2+)-ATPase活力稍有下降,并观测到CF1蛋白在277nm和295nm两个波长下的荧光发射光谱的荧光峰强度均明显减弱,说明四环素在CF1上有作用部位。随后,分别用作用于CF1的整个结构、γ亚基和β亚基的戊二醛、NEM和TNBS处理CF1,比较四环素处理后的CF1荧光发射光谱和这些已知与CF1各亚基有相互作用的药物处理后的荧光发射光谱的差异。其结果呈现这些处理与四环素处理的CF1荧光发射光谱的峰位相同,但戊二醛、NEM和TNBS处理后的CF1荧光发射光谱的峰值均低于对照。用50μmol/L四环素处理后的发射光谱峰值更接近于NEM处理后CF1的发射光谱。由此初步推测,四环素在CF1上的作用部位在其γ亚基上或其邻近部位,四环素的结合加强了ATP合酶亚基间的相互作用,增加了跨类囊体膜两侧的质子动力势,从而促进ATP合成和提高P/O值。 2. 用定点突变的方法将叶绿体ATP合酶ε亚基第47 位甘氨酸替换成亮氨酸,精氨酸,丙氨酸和谷氨酸,分别产生εG47L, εG47R, εG47A and εG47E四个突变体。这些突变体对CF1(–ε) 的Ca2+-ATPase活性的抑制均比野生型的弱。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q946

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