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《中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)》 2005年
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酵母端粒酶核心酶的纯化和定性研究

廖新化  
【摘要】:端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它能在体内延伸染色体单链末端,在体外延伸寡聚核苷酸。一般认为端粒酶的蛋白催化亚基和RNA亚基组成了核心酶,它们对体外活性是必需的。我们在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中共表达了GST融合的酵母端粒酶的蛋白催化亚基Est2p和RNA亚基Tlc1,重建了端粒酶的活性。我们用硫酸铵沉淀分级分离和亲和纯化方法部分纯化了GST-Est2p/Tlc1 复合体。通过质谱和Western杂交鉴定,这个纯化的复合体不包含内源的端粒酶全酶的另外两个亚基:Est1p和Est3p。纯化的Est2p/Tlc1 复合体在体外可以特异地有进行性地(processively)把核苷酸掺入到单链的TG1-3重复的引物上,但不能转位启动第二轮端粒重复序列的合成。当引物匹配在Tlc1 模板区的不同位置时,纯化的核心酶显示出不同的活性。我们建立的纯化和重建端粒酶核心酶的方法,可以用来进一步研究端粒酶全酶的其它亚基及其调控蛋白的调控机制。 人们在端粒酶的催化亚基中鉴定出了逆转录酶结构域,这个结构域被认为是端粒酶的活性中心。我们发现从酵母表达系统中纯化的GST 融合的Est2p 和人的端粒酶催化亚基hTERT 样品在体外具有普通逆转录酶活性。当逆转录酶结构域中的关键氨基酸Asp670 突变为Ala 时,突变的Est2p 在体内不能互补野生型的Est2p 的功能,并且纯化的突变的端粒酶复合体的端粒酶活性完全丧失了。但是,纯化的突变的Est2p 和hTERT 的逆转酶活性和野生型的差不多。这提示酵母中可能还存在一种内源的与端粒酶催化亚基相互结合的蛋白提供了逆转录酶活性。此外,纯化的端粒酶催化亚基样品还具有DNA 聚合酶的活性。这些新的发现提示端粒酶催化亚基可能参与其它的细胞功能。鉴定Est2p 自身的逆转录酶活性以及相互结合蛋白的逆转录酶活性还需要进一步研究。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(上海生命科学研究院)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q946.5

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