1.染色体大片段的遗传操作 2.siRNA作用靶点的筛选和shRNA的转录调控

【摘要】： 本论文分为两个部分,共六章,第一部分主要工作为染色体大片段的遗传操作,其中包括三章,第一章为应用Cre-LoxP系统在细胞内原位套取染色体大片段;第二章为用TAR((transformation-associate recombination)建立hIGH基因YAC文库;第三章为文献综述;第二部分主要讨论siRNA作用靶点的筛选和shRNA的转录调控,也分为三章,第四章为体外无细胞系统快速有效地筛选siRNA位点;第五章为可调控的shRNA的转录;第六章为文献综述. 第一章:细胞内原位直接定点切割和扩增特定基因大片段,可以获得需要的基因簇。我们利用Cre-LoxP系统,分别将两个LoxP位点定点整合到免疫球蛋白重链基因两侧,再经Cre酶作用,经药物筛选得到具有环状YAC的细胞克隆。经Southern blot和FISH等鉴定,这一环状结构可以稳定的在细胞中存在。用此项技术能直接获得特定基因大片段,可以用于定点克隆基因大片段,基因治疗和基因功能等研究上。 第二章:酵母具有较高的同源重组效率,我们在转染酵母时,hIgH基因C区和V区两个同源臂,与人胚胎肝细胞基因组DNA共转染,在酵母内同源重组后,hIgH基因片断从人细胞基因组中直接克隆出来,形成一个YAC库。经PCR检测,该库中的YAC克隆涵盖了hIgH基因C,J,D,V四个区。此法避免了在体外克隆大片段时的烦琐,冗长,费时的筛选,酶切,连接过程。 第三章:概述了基因靶位操作的原理和策略;对近年来在同源重组技术上的进展做了简要介绍,着重讲述了哺乳动物细胞的同源重组和筛选策略。