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基因改造兔技术平台的建设

石建军  
【摘要】: 兔是使用非常广泛的实验动物和经济动物。与小鼠相比,兔个体中等,血液量大,是研究心血管系统,肺部疾病,眼科疾病,药物毒性试验,代谢疾病的合适动物模型。因此,通过基因改造产生的兔变异株有着良好的应用前景和市场价值。首先,通过基因修饰,可以产生许多人类疾病的动物模型,包括动脉硬化、癌症、爱滋病和肥厚性心肌病等的疾病模型,以补充小鼠模型在这方面的不足。第二,根据毒理分析和药物筛选的需要,可以产生特定的基因修饰兔,以供生产需要。第三,利用特殊启动子驱动乳腺或血液特异性表达,用兔作为生物反应器,生产药用蛋白。 近来,我们实验室成功分离了兔的胚胎干细胞,并建立了兔的克隆技术,可以从体细胞或胚胎干细胞生产健康成年兔。这个技术体系的建立就使得通过基因改造技术生产特殊用途兔品系成为可能。目前,我们实验室正在建立“基因改造-克隆兔”的技术平台,它包括两大部分,基因改造和兔的克隆。本论文主要致力于兔基因改造技术的建立,将分子修饰技术与干细胞及动物克隆技术结合起来,生产特殊用途的兔品系。同时,该技术平台的建立也使得我们可以利用兔系统来研究发育过程和疾病过程中的分子调控。 为建立兔的基因打靶系统,我们克隆了兔的HPRT基因及其cDNA,并构建了该基因的敲除打靶载体和插入打靶载体。此外,我们还克隆了兔的POU5F1基因(编码Oct4蛋白)及其cDNA,并构建了POU5F1基因的插入打靶载体。这种HPRT基因修饰过的兔品系不但可以促进兔同源重组技术的建立(可用于基因修饰细胞的筛选),也可用作为研究人类相关疾病的动物模型。另一方面,POU5F1基因改造的兔品系则可被用作发育生物学研究的动物模型。 由于兔的基因组序列还未测定,我们做了大量的基础工作,用常规的分子克隆方法获取cDNA序列和基因组序列的信息。为了提高对大片段DNA的克隆和修饰能力,我们还引进了分子重组系统(recombineering),大大提高了效率。此外,为了验证分子修饰技术确实可以和动物克隆技术很好衔接,作为预实验,我们将转染后稳定表达红色荧光蛋白(RFP)的兔成纤维细胞作为核供体获得了转RFP基因的克隆胚胎,并进行了胚胎移植。 这些工作将分三个部分详细阐述。


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