羊草生殖生物学研究

【摘要】：羊草(Leymus chinensis(Trin．)Tzvel．)，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草 原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战 略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了 羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性 的有关机理。本论文的主要结果如下： 1． 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6个羊草居群为材料，测定得知 开放授粉时的结实率在6． 5％-56． 7％之间，自交时结实率为O．6％-4． 3％，差异 极其显著；FDA染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到 92． 2％以上；在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和白花 授粉；花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5． 5％-11． 7％是亲和的，杂交 花粉亲和率达到了60． 0％-84． 8％，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其 次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延 伸。 2． 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草 杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0％-6． 9％， 杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点(47． 5％-96． 0％)，且 正反交结果具有一定的一致性(88． 2％)，表现出配子体遗传特性。 3． 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随 机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4． 6％，18． 1％和 35． 7％，株间的变异系数分别为33． 4％，21． 2％和17． 1％，这些株间的变异均达 到统计上的显著差异；同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关 性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4． 分离了羊草硫氧化还原蛋白H基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克 隆了ThtoLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包 括3个内含子和4个外显子，与水稻Thtoh的cDNA序列相比，具有32.0%的 同源性;Southem杂交显示介ioLc在羊草基因组中是单拷贝;Northem杂交显 示ThtoL。在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达，在成熟雌蕊和幼小的花 粉中微量表达，在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H基 因具有花粉特异表达特点。 5.原核表达的ThioLc蛋白具有较高的催化活性。构建了介ioLc基因的原 核表达载体，检测证明ThtoLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白， 纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应， 结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该 蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。 关键词:羊草，有性生殖，自交不亲和性，硫氧化还原蛋白，基因克隆， Southem杂交，Norihern杂交，酶活性