Nifedipine调节白皮松（Pinus bungeana）花粉管蛋白质表达及其对细胞壁构建的影响

【摘要】：花粉管是种子植物受精过程中的雄性生殖单位的载体,由于其生长依赖于胞内Ca~(2+)梯度,并具有典型的顶端极性生长的特点,因而成为近年来研究植物细胞相互识别、胞内和胞外信号传导理想的模式系统。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢等特点。Ca~(2+)在裸子植物花粉萌发和花粉管生长中的作用机制目前尚不明确。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)的花粉为材料,运用不同浓度钙通道抑制剂Nifedipine(Nif)处理,对其花粉萌发和花粉管生长进行了细胞学研究和蛋白质组学分析,以探讨Ca~(2+)对白皮松花粉生长的调控机制,为进一步揭示裸子植物花粉萌发和花粉管生长机理提供参考。 本论文首先研究了钙通道抑制剂Nif和Ca~(2+)螯合剂EGTA对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明,用Nif处理花粉后,花粉萌发和花粉管生长均受到明显抑制。经Ca~(2+)荧光探针Fluo-3AM标记,对Nif处理后Ca~(2+)在花粉管中的分布模式进行了观察,发现Ca~(2+)在正常生长的花粉管中呈梯度分布,并在其顶端的荧光最强。与对照相比,处理后的花粉管荧光强度明显减弱,且顶端Ca~(2+)梯度消失。通过EGTA漂洗后的花粉粒,在正常培养基上萌发率较高,但其生长速率受到抑制。由此说明了细胞壁钙库对花粉管生长的抑制效应显著高于对花粉萌发的影响,是花粉管生长的限速因子。同时外加钙调素还可逆转EGTA对其花粉萌发和花粉管生长的抑制。上述结果表明,白皮松花粉萌发及花粉管生长需要外源Ca~(2+)的内流,以及胞内形成的Ca~(2+)浓度梯度。 用FM4-64探针标记结果发现,正常花粉管中的胞吞作用主要发生在顶端和亚顶端区域,胞吞的小泡也集中分布在这两个区域。经Nif处理后,既不影响花粉管的胞吞过程,同时胞吞发生的位置也与对照相似,只是胞吞的小泡分散于整个花粉管中。电子显微镜观察表明,各种细胞器在白皮松正常生长的花粉管中分布与被子植物存在较大差异,例如前者无明显地分区现象,不具胼胝质塞。白皮松花粉管顶端和亚顶端的壁旁体与质膜融合现象频繁发生。花粉管经Nif处理后,线粒体出现不同程度的解体和液泡化,内质网液泡化和核糖体脱落,液泡大量聚集在花粉管顶端,壁旁体与膜融合现象减少,以及花粉管壁明显变薄等。此外,通过微丝特异性探针鬼笔环肽标记结果表明,正常生长花粉管的微丝呈长轴向排列, Nif处理后微丝断裂,其断裂程度与处理浓度有关。由此可见,外源Ca~(2+)对花粉管的胞吞无明显