收藏本站
《中国科学院研究生院(成都生物研究所)》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

青稞B组醇溶蛋白基因与上游调控区的克隆及基因表达

韩兆雪  
【摘要】: 高等植物种子胚乳贮藏蛋白是种子发芽时的主要氮源,也是人类和动物食用植物蛋白的主要来源。大麦种子胚乳贮藏蛋白主要是醇溶蛋白(hordeins),占大麦胚乳总蛋白的50-60%。根据大麦醇溶蛋白的大小和组成特点,大麦醇溶蛋白被划分为三种类型:富硫蛋白亚类(B,γ-hordeins)、贫硫蛋白亚类(C-hordeins)以及高分子量蛋白亚类(D-hordeins)。B组和C组醇溶蛋白是大麦胚乳的两类主要贮藏蛋白,它们分别占大麦总醇溶蛋白成分的70-80%和10-12%。遗传分析表明,大麦B、C、D和γ-组醇溶蛋白分别是由位于大麦第五染色体1H(5)上的Hor2、Hor1、Hor3和Hor5位点编码。Hor2位点编码大量分子量相同但组成不同的B组醇溶蛋白(B-hordein)。B-hordein的种类、数量和分布是影响大麦酿造、食用及饲养品质的重要因素之一。为深入了解B-hordein基因家族的结构和染色体组织,探明Hor2位点基因表达的发育调控机制,最终达到改良禾谷类作物籽粒品质的目的,本研究以青藏高原青稞为材料,采用同源克隆法,分别克隆B-hordein基因和启动子,通过原核生物表达验证B-hordein基因功能,并利用实时定量PCR探索B-hordein基因表达时空关系,取得如下研究结果: 1.以具有特殊B组醇溶蛋白亚基组成的9份青藏高原青稞为材料,根据GenBank中三个B-hordein基因序列(GenBank No.X03103,X53690和X53691)设计一对引物,通过PCR扩增,获得23个B-hordein基因克隆并对其进行了序列分析。核苷酸序列分析表明,所有克隆均包含完整的开放阅读框。有11个克隆都存在一个框内终止密码子,推测这11个克隆可能是假基因。推测的氨基酸序列分析表明,所有大麦B-hordein具有相似的蛋白质基本结构,均包括一个高度保守的信号肽、中间重复区以及C-端结构域。不同大麦种重复区内重复基元的数目有较大差异。青稞材料Z07-2和Z26的B-hordeins仅具有12个重复基元结构,更接近于野生大麦。这些重复基元数目的差异导致了重复区序列长度和结构的变异。这种现象极可能是由于醇溶谷蛋白基因在进化过程中染色体的不平衡交换或复制滑动所造成的。对所克隆基因和禾本科代表性醇溶谷蛋白基因进行聚类分析,结果表明所有来自栽培大麦的B-hordeins聚类成一个亚家族,来自野生大麦的B-hordeins以及普通小麦的LMW-GS聚类成另外一个亚家族,表明这两个亚家族的成员存在显著差异。此外,我们发现B-hordein基因推测的C-末端序列具有一些有规律的特征:即具有相同C-末端序列的B-hordein基因在系统发生树中聚类为同一个亚组(除BXQ053,BZ09-1,BZ26-5分别单独聚为一类外)。这个特征将有助于我们对所有B组醇溶蛋白基因家族成员进行分类,避免了在SDS-PAGE电泳图谱上仅依靠大小分类的局限性。 2.根据上述克隆的青稞B-hordein基因的5’端序列设计三条基因特异的反向引物,以青稞Z09和Z26的基因组DNA为模板,采用SON-PCR和TAIL-PCR技术分离克隆出8个B-hordein基因的上游调控序列(命名为Z09P和Z26P)。序列分析表明,推测的TATA box位于-80 bp,CAAT-like box位于-140 bp处。此外,Z09P和Z26P中有六个序列在-300 bp处均存在一个由高度保守的EM基序和类GCN4基序构成的胚乳盒(Endosperm Box,EB),在约-560 bp处存在一个胚乳盒类似结构。而Z09P-2和Z26P-3不存在保守的胚乳盒或其类似结构,预示着这两个启动子所调控的基因表达可能受不同类型反式作用因子的调节,推测该启动子对基因的表达调控具有多样性。 3.将B-hordein基因的开放阅读框定向克隆到表达载体pET-30a中,将其导入大肠杆菌表达菌株BL21中进行外源基因的诱导表达以验证所克隆基因的功能。结果表明仅含重组子pET-BZ07-2和pET-BZ26-5的BL21细菌有目的表达蛋白产生。在诱导3h时的蛋白表达量最高;3 mM IPTG诱导的蛋白表达量要高于1 mM IPTG诱导的表达量。这为分离纯化B-hordein蛋白以及进一步研究其对大麦籽粒品质的影响奠定基础。 4.根据从青稞Z09和Z26中分离克隆的B-hordein基因序列设计一对基因特异的引物,同时,选择大麦α-微管蛋白基因(GenBank no.U40042)为看家基因并设计特异引物,利用实时荧光定量PCR检测了青稞籽粒4个胚乳发育时间段的B-hordein基因表达,荧光定量结果显示:两份材料中B-hordein基因的表达量均随发育过程的进行而逐渐升高。Z09中B-hordein基因在开花后7天开始转录,而Z26开花4天后就有低水平B-hordein的表达,这表明Z26中B-hordein基因可能比Z09表达的较早或者Z09中B-hordein基因表达水平较低以致于不能被检测到。此外,在4个不同的胚乳发育时期中,Z26中B-hordein基因的表达量均高于Z09材料。在开花12天到18天的过程中,Z09和Z26中B-hordein基因的表达水平有一个急剧性的升高。这说明在不同胚乳发育时期,Hor2位点的B-hordein等位基因变异体存在mRNA的差异表达。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(成都生物研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S512.3

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王颖,麦维军,梁承邺,张明永;高等植物启动子的研究进展[J];西北植物学报;2003年11期
2 阎其涛,李建粤,米东,刘佳;重要谷类种子贮藏蛋白的特性及改良研究[J];西北植物学报;2004年04期
3 谢迎秋,孟蒙,朱祯;植物反式作用因子研究进展[J];高技术通讯;2000年02期
4 程世军,王宗阳,洪孟民;水稻bZIP蛋白REB结合Wx基因启动子中的GCN4基序[J];中国科学(C辑:生命科学);2002年01期
5 张秀君,刘俊起,赵倩,于静娟,敖光明;用基因枪将高赖氨酸基因导入玉米及转基因植株的检测[J];农业生物技术学报;1999年04期
6 于翠梅;马莲菊;张宝石;;特异性启动子在植物基因工程中的应用[J];生物工程学报;2006年06期
7 高新起;种子贮藏蛋白的运输、积累和基因表达调控[J];细胞生物学杂志;2005年01期
8 湛小燕;大麦醇溶蛋白研究概况[J];遗传;1990年06期
9 张宪银,薛庆中;用农杆菌介导法将大豆球蛋白基因导入水稻[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2001年05期
10 路静,赵华燕,何奕昆,宋艳茹;高等植物启动子及其应用研究进展[J];自然科学进展;2004年08期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 潘志芬;青藏高原栽培青稞遗传多样性研究[D];中国科学院研究生院(成都生物研究所);2006年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 姜先荣;杨杰;周衍茂;;转基因技术应用及转基因产品安全性研究进展[J];合肥师范学院学报;2008年03期
2 高艾英;张昊;湛平;王宪泽;;小麦醇溶蛋白等位基因研究进展[J];山东农业科学;2007年01期
3 刘源霞;兰进好;杜景平;孙洪岩;;转基因玉米研究进展[J];山东农业科学;2007年06期
4 张林;樊庆琦;隋新霞;楚秀生;李根英;程敦公;黄承彦;;小麦部分重要性状分子标记研究进展[J];山东农业科学;2008年07期
5 丁建刚;胡定慧;;农杆菌介导的莴笋遗传转化体系的初步研究[J];安徽农学通报;2008年04期
6 黄炎;郭庆水;徐立新;陈守才;;三种天然橡胶树DNA提取方法的比较研究[J];安徽农学通报;2008年07期
7 陈霞;罗世巧;段翠芳;曾日中;;高等植物转录因子研究进展[J];安徽农学通报;2008年09期
8 黄敏,杜何为,张祖新;玉米转基因技术研究进展[J];安徽农业科学;2004年05期
9 安运华;;兰花基因工程研究进展[J];安徽农业科学;2006年01期
10 张少斌;刘慧;;农作物抗虫蛋白质工程及其应用[J];安徽农业科学;2006年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱林;江昌俊;叶爱华;李叶云;余梅;邓威威;;茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
2 樊荣辉;黄敏玲;钟淮钦;吴建设;林兵;叶秀仙;罗远华;;鹤望兰蓝色花相关基因克隆及表达分析[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
3 彭文涛;汪峰;崔中利;曹慧;;转基因棉花种植对土壤卡那霉素抗性细菌多样性的影响[A];第五次全国土壤生物和生物化学学术研讨会论文集[C];2009年
4 ;Cloning and expression of low-molecular-weight glutenin genes from Chinese elite wheat cultivar "xiaoyan 54[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
5 丁国华;秦智伟;周秀艳;范金霞;;黄瓜霜霉病抗病基因(dm)的RAPD及SCAR分子标记[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年
6 于占东;赵双宜;何启伟;王翠花;牟晋华;刘春香;;抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的研究[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年
7 黄骐;林建丽;王冰梅;叶冰莹;陈由强;陈如凯;;农杆菌介导花生白藜芦醇合酶基因转化马铃薯的研究[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
8 赵运军;何利刚;王会良;许淼;刘德春;孙中海;;枳壳CBF1类似基因PtCBF1启动子的克隆与生物信息学分析[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
9 王沛;周洲;尹新明;;菊花“绿鹦哥”遗传转化系统的研究[A];河南省植保学会第九次、河南省昆虫学会第八次、河南省植病学会第三次会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2009年
10 赵惠贤;王瑞娟;郭蔼光;;小麦低分子量麦谷蛋白基因的克隆与序列分析[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 高晓阳;甘肃河西大麦麦芽干燥控制系统研究[D];甘肃农业大学;2010年
2 曾卫军;拟南芥(Arabidopsis thaliana)受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究[D];华东师范大学;2011年
3 张立;单宁酸对面包烘焙品质影响及其作用机理研究[D];华中科技大学;2010年
4 张妙霞;野生香蕉(Musa spp., AB group)抗寒相关基因的克隆与表达分析[D];福建农林大学;2010年
5 李光蓉;小麦族物种α-醇溶蛋白基因的克隆与分子进化研究[D];电子科技大学;2010年
6 王猛;马尾松抑制消减文库的构建及抗病性相关基因的克隆[D];中南林业科技大学;2010年
7 刘缙;银杏种仁抗菌蛋白基因工程研究及小麦胚乳特异启动子的鉴定和评估[D];西北农林科技大学;2010年
8 徐伟荣;中国华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因及启动子克隆与功能分析[D];西北农林科技大学;2010年
9 孙翊;瓜叶菊PCFH基因对花青素苷合成及花色的影响[D];北京林业大学;2011年
10 苏长青;适合转基因抗虫水稻和棉花PCR检测标准质粒的构建及试用[D];中国农业科学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李智;梨抗黑星病类似基因Hcrp和启动子克隆与类受体蛋白分析[D];华中农业大学;2010年
2 刘红梅;农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立[D];华中农业大学;2010年
3 刘冉冉;枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究[D];华中农业大学;2010年
4 王岩;早实枳成花相关基因的表达分析及PtFLC的功能特征[D];华中农业大学;2010年
5 高艳平;蓖麻成熟期胚抑制消减cDNA文库构建及其差异表达基因分析[D];华中农业大学;2009年
6 曹玲;AM真菌孢子萌发及其与紫云英转化根双重培养体系建立的研究[D];华中农业大学;2009年
7 朱莹;分析耐盐基因与启动子功能的CRE/loxP重组激活系统的构建与检验[D];哈尔滨师范大学;2010年
8 徐娟;农杆菌介导的Ac/Ds转座系统转化甘蓝型油菜的研究[D];郑州大学;2010年
9 张鲁军;离子束诱导普通小麦小偃81 HMW-GS 1Ax1缺失突变家系突变机制研究[D];郑州大学;2010年
10 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 谈建中,楼程富,钟名其,平野久;大豆球蛋白基因表达载体的构建及对桑树的遗传转化[J];蚕业科学;1999年01期
2 马得泉,李雁勤;中国近缘野生大麦种质资源的收集与性状鉴定[J];大麦科学;1997年01期
3 栾运芳,何燕;西藏青稞品质改良的趋势及对策[J];大麦科学;2004年02期
4 王晓娟,李兴林,王亚馥;高粱总DNA导入春小麦稳定后代高分子量麦谷蛋白亚基的变化[J];西北植物学报;2000年06期
5 周晓红,陈晓光,张晓东,王亚楠,李林,习佳飞,胡建军;番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析[J];第一军医大学学报;2003年01期
6 冯宗云,张义正,张立立,凌宏清;应用微卫星标记研究西藏野生二棱大麦的遗传多样性及地理分化[J];高技术通讯;2003年10期
7 杨之帆,罗忠训,夏胜,周炜;一个含有玉米器官专一性启动子的表达质粒的构建[J];湖北大学学报(自然科学版);1998年03期
8 洪亚辉,萧浪涛,董延瑜;玉米DNA导入水稻选育高蛋白品系[J];湖南农业大学学报;2000年01期
9 朱至清,王敬驹,孙敬三,徐振,朱之垠,尹先初,毕凤云;通过氮源比较试验建立一种较好的水稻花药培养基[J];中国科学;1975年05期
10 王国英,杜天兵,张宏,谢友菊,戴景瑞,米景九,李太源,田颖川,乔利亚,莽克强;用基因枪将Bt毒蛋白基因转入玉米及转基因植株再生[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1995年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杜俊波;席德慧;王尚英;冯鸿;孙歆;袁澍;王建辉;刘自礼;薛立微;林宏辉;;青稞脱水素基因dhn4的克隆与原核表达[J];四川大学学报(自然科学版);2008年02期
2 潘志芬;唐亚伟;吴芳;韩兆雪;邓光兵;余懋群;;青藏高原青稞B组醇溶蛋白遗传多样性研究[J];应用与环境生物学报;2006年05期
3 邱绍军,罗旭东,王有魁;北青四号青稞高产农艺措施产量数学模型研究[J];大麦科学;1997年03期
4 李云祥,陈殿民;甘南高寒地区青稞氮磷肥配施效应及效益研究[J];土壤通报;1998年01期
5 刘梅金,陈丽娟,尚晓花,郭建炜;甘南州青稞新品种(系)引种试验结果[J];甘肃农业科技;2004年12期
6 韩建琪;马德林;;青稞新品种柴青1号良种繁育技术[J];中国农技推广;2011年01期
7 何长芳,严林;青稞种植区高原鼢鼠防治指标初报[J];青海草业;2001年01期
8 和卫泽,邹薇,李德元,和茂昌,唐世文,谢世清;不同播种量对春青稞主要农艺性状和产量的影响[J];云南农业科技;2004年03期
9 郭辉丽;甘南高海拔地区青稞地膜穴播栽培试验初报[J];甘肃农业科技;2004年11期
10 马振君;;门源地区北青8号青稞丰产栽培技术要点[J];青海农技推广;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 赵宇玮;贾敬芬;;青稞甜菜碱醛脱氢酶基因hvbadh1的克隆及原核表达[A];中国细胞生物学学会第九次会员代表大会暨青年学术大会论文摘要集[C];2007年
2 辛英豪;高继明;刘标;李莎莎;姜世金;;Ⅰ型鸭病毒性肝炎VP1基因的克隆与原核表达[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年
3 焦石;贾立军;薛书江;刘明明;黄国明;张守发;;牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
4 彭跃跃;丁燏;简纪常;鲁义善;;南极衣藻γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)基因的克隆,原核表达及定量分析[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
5 岳亮;王艺磊;张子平;林鹏;邹志华;谢芳靖;陈锦民;冯建军;;日本囊对虾Cathepsin B基因的克隆与原核表达[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
6 孟先明;潘艳;蔡新斌;陆专灵;梁湘;唐海波;杨剑;张红普;罗廷荣;;狂犬病毒ERA株基质蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年
7 叶明强;杨婉莹;邓小娟;韩冬;曹阳;温硕洋;夏庆友;;家蚕拟抗微生物肽Bmatt 1基因的原核表达及抗菌活性鉴定[A];格莱姆抗菌肽——抗菌肽开发与应用技术研讨会论文集[C];2009年
8 赵刚;李刚;范晓娟;;狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
9 李凯;高宏雷;祁小乐;高玉龙;高立;邓小芸;王笑梅;;禽网状内皮组织增生病病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备[A];全球肉鸡产业论坛暨第二届中国白羽肉鸡产业发展大会会刊[C];2010年
10 宋艳;柳学广;朱晓苏;徐丽;司马杨虎;徐世清;;野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 邓安华;省青稞工程技术研究中心落户我州[N];甘孜日报(汉文);2006年
2 记者 李毅铭;迪庆青稞增收课题通过验收[N];云南日报;2007年
3 本报记者 刘国庆;白朗老百姓种青稞 越种越开心[N];日喀则报;2008年
4 记者 李京华 裘立华;雪域高原万亩青稞再获丰收[N];新华每日电讯;2000年
5 本报记者 康守永;西藏:青稞何以又得宠?[N];经济日报;2001年
6 记者 朱晓雯;廉价白酒冒充“互助青稞散酒”[N];西宁晚报;2010年
7 记者 程晓红 见习记者 王杰;改变传统作坊生产格局我区青稞食品实现工业化生产[N];西藏日报;2004年
8 本报记者 麦正伟;机声隆隆秋收忙[N];西藏日报(汉);2011年
9 记者 邓安华 袁飞;我州青稞膨化食品试制成功[N];甘孜日报(汉文);2006年
10 ;亦药亦食青稞的华丽蝶变[N];粮油市场报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 韩兆雪;青稞B组醇溶蛋白基因与上游调控区的克隆及基因表达[D];中国科学院研究生院(成都生物研究所);2007年
2 赵宇军;猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因表达及其基因特异性噬菌体展示肽库构建[D];中国农业科学院;2005年
3 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
4 陈立志;牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D];吉林大学;2008年
5 李静;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
6 游向荣;龙眼成花转变与成花逆转的差异蛋白质组学研究[D];福建农林大学;2009年
7 许波;抗菌/抗内毒素多肽葛佬素的表达、纯化及其生物活性的初步研究[D];第四军医大学;2004年
8 孙照刚;传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组[D];中国农业大学;2005年
9 郑银英;苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究[D];华中农业大学;2005年
10 姜秀云;牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究[D];吉林农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈雄艳;人IL-24基因的克隆、表达及活性鉴定[D];苏州大学;2004年
2 赵艳丽;水稻中DNA甲基转移酶的原核表达及功能初步鉴定[D];东北师范大学;2010年
3 丁彪;小鼠IFRG15基因在植入前胚胎及原核表达的研究[D];安徽农业大学;2010年
4 牟静;多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因的克隆与原核表达[D];四川农业大学;2010年
5 刘志强;抗Cyclin D1人源胞内单链抗体的原核表达与鉴定[D];吉林大学;2011年
6 王轶;甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达[D];四川大学;2005年
7 张淑华;心肌型脂肪酸结合蛋白的原核表达与应用研究[D];吉林大学;2006年
8 王云珑;拟南芥Athspr突变体的耐热性分析及Athspr基因的原核表达[D];兰州大学;2010年
9 李会娟;家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
10 欧阳锦凤;人博卡病毒结构蛋白VP1u,非结构蛋白ORFx和NP1的原核表达与抗体制备[D];华中师范大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026