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《中国科学院研究生院(水生生物研究所)》 2005年
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牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析

杜昌升  
【摘要】:牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一个优良的高效海水养殖品种。目前在国内被广泛养殖,给养殖业创造了良好的经济效益。但是目前的主要养殖方式是室内工厂化,与海上的网箱养殖相比,养殖密度大,水质容易恶化,称为各种疾病的诱因,而且牙鲆具有水底集群的习性,使得疾病传染加剧,虽然利用一些药物取得了一定的防治效果,但是长期的施药不仅会导致水体的污染,也会造成诸多耐药性病原体的产生,为进一步的防治工作变得更为复杂。因此进行牙鲆相关的鱼类免疫学研究是必要和必须的。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面: 首先,探索了SMRV 病毒和鱼类培养细胞的相互作用,结果发现,SMRV 病毒感染的CLC 细胞死亡途径主要是细胞凋亡,凋亡的发生基本上不影响子代病毒粒子的复制,而病毒的复制对细胞凋亡的发生则是必须的。 其次,以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR 扩增后,取正向差减的PCR 产物与T 载体连接,构建抑制差减cDNA 文库,随机挑取7400 余个克隆,对其中4200 多个克隆进行PCR 扩增鉴定,发现近4000 个克隆中均含有插入片段,大小在250-1000bps 之间,进一步对含有插入片段的近4000 个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668 个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA 文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。第三,构建SMART-cDNA 文库并结合RACE 技术成功克隆到了cystein proteinase, decorin, NDPK, RACK, chemokine 等重要的免疫相关基因,这些基因在牙鲆中都是首次被克隆鉴别,利用对它们的RT-PCR 分析表明,不同的基因在细胞及组织上具有不同的时空分布。 最后,对decorin 基因进行了进一步的重组原核表达载体的构建、原核表达、蛋白纯化、抗体制备,对肝、脾、头肾、后肾、皮肤、心、肌肉、脑、肠、鳃、卵巢、精巢等组织中的decorin 表达蛋白进行的western blot 分析表明在检测
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(水生生物研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S917.4

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 吕爱军;三种养殖鱼类抗病毒免疫的初步研究[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2007年
2 陈玉栋;病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2006年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 江育林,李正秋;病毒感染的草鱼细胞产生类干扰素物质的研究[J];病毒学报;1991年01期
2 邵健忠,项黎新,李亚南;草鱼干扰素诱生条件的研究[J];水产学报;1999年02期
3 张义兵,石耀华,桂建芳;鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建[J];水生生物学报;2003年02期
4 张义兵,王铁辉,李戈强,贾方钧,俞小牧;鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性[J];中国病毒学;2000年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 丰培金;;鱼类的白细胞介素研究进展[J];安徽农业科学;2006年17期
2 邵健忠,项黎新,李亚南,毛树坚;从草鱼细胞分离到一种抗出血病病毒蛋白因子的研究[J];病毒学报;1993年04期
3 邵健忠,项黎新;草鱼干扰素的免疫调节功能[J];动物学报;2001年04期
4 邵健忠,项黎新;草鱼干扰素的体外诱生及其组织细胞的来源[J];动物学报;2001年06期
5 贾方钧,王铁辉,张义兵,俞小牧,李戈强;干扰素防治草鱼出血病的效果初探[J];水产科学;2000年04期
6 吴晓松;商巾杰;范云燕;蒋莹;姚姿婷;陈辉;陈保善;;大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除[J];广西农业生物科学;2005年04期
7 张义兵,王铁辉;几种鱼类培养细胞对不同干扰素敏感性的研究[J];海洋湖沼通报;2000年03期
8 李军,王铁辉,陆仁后,陈宏溪;草鱼出血病病毒的研究进展[J];海洋与湖沼;1999年04期
9 邵健忠,项黎新;PHA体外诱导草鱼白细胞产生γ-干扰素的研究[J];海洋与湖沼;2001年02期
10 高春萍,蔡中华,宋林生,吴龙涛,池振明;黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)肿瘤坏死因子α cDNA的克隆及特征分析[J];海洋与湖沼;2005年04期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 陈松林;;水产养殖生物基因组的研究现状和发展趋势[A];2002年世界水产养殖大会论文交流综述[C];2002年
2 HE Chong-bo , Wang Qiang, Xu Xiao-hong ( Uaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Liaoning Open Lab of Applied Marine Biotechnology, Uaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology, Dalian 116023, China);Advance of studies on fish chemokine genes involved in innate immunity[A];生物技术对水产业的促进作用——2005水产科技论坛论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 范德刚;骨肉瘤转移相关基因筛选研究和BLCAP基因克隆、表达及初步功能研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
2 倪晓华;人类基因PanK、Rab2B、NM23-H1B和VRK3的克隆和功能研究[D];复旦大学;2003年
3 陈颖;PTEN及肿瘤相关基因在正常卵巢及卵巢良、恶性病变中的改变和意义[D];中国医科大学;2004年
4 沈利;人类新基因BNIPL生物学功能的初步研究[D];复旦大学;2004年
5 李文;卵巢癌相关新基因NM23-H1B的克隆和功能研究[D];第二军医大学;2004年
6 刘荭;聚合酶链式反应和基因芯片技术的研究及在主要水生动物病毒检疫和监测中的应用[D];华中农业大学;2004年
7 李印;nm23-H1基因转染对人肺癌细胞中Ras-to-MAPK信号传导通路影响的实验研究[D];四川大学;2004年
8 崔曙;nm23-H_1基因转染人膀胱癌T-24细胞株的实验研究[D];四川大学;2005年
9 杨晓梅;棉铃虫个体发育过程中组织蛋白酶B的表达及功能研究[D];山东大学;2005年
10 李莲瑞;鲤鱼(Cyprinus carpio L.)外周血白细胞cDNA文库的构建和差异表达基因的筛选[D];吉林大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴琼;昆虫抗病毒活性物质的诱导及其鉴定[D];华中师范大学;2001年
2 徐炳森;草鱼白细胞介素-2基因克隆、序列分析及其在原核细胞中表达的研究[D];浙江大学;2001年
3 金红建;鱼类几种免疫相关基因的克隆与鉴定[D];浙江大学;2002年
4 吴予平;抑癌基因nm23-H1表达的增高及其对LA-795细胞的影响[D];暨南大学;2002年
5 徐周敏;新的白血病相关基因LRP15的克隆及其功能的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
6 陈开健;重组人-α干扰素基因(Hu-IFN-α)在草鱼体内的整合与表达[D];湖南农业大学;2003年
7 杨敬辉;BARODON对中华鳖免疫功能的影响[D];河北农业大学;2003年
8 于淼;鲨鱼肝实质细胞培养及其细胞膜分离纯化的方法学研究[D];中国海洋大学;2002年
9 孙钢;Nm23-H1cDNA片段克隆及腺病毒载体的构建[D];昆明医学院;2003年
10 李长毅;nm23-H_1基因杂合性缺失与肺癌生物学特性[D];重庆医科大学;2004年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 钱云霞,王国良,邵健忠;鱼类的非特异性免疫调节[J];宁波大学学报(理工版);2000年01期
2 江育林,李正秋;病毒感染的草鱼细胞产生类干扰素物质的研究[J];病毒学报;1991年01期
3 李亚南;嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白分析[J];动物学报;2001年02期
4 陈垚,王石泉,韩晓冬,侯亚义;鲫鱼血清和皮肤粘液IgM的分离纯化及部分性质的鉴定[J];动物学研究;2003年02期
5 张义兵,王铁辉;几种鱼类培养细胞对不同干扰素敏感性的研究[J];海洋湖沼通报;2000年03期
6 张伟权,于琳江,童保福,李光友,丁美丽,鲍鹰,何晋伟,王世震,C.R.阿诺尔特,张仕君;南美洲白对虾全人工授精技术研究[J];海洋与湖沼;1993年04期
7 高春萍,蔡中华,宋林生,吴龙涛,池振明;黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)肿瘤坏死因子α cDNA的克隆及特征分析[J];海洋与湖沼;2005年04期
8 章跃陵,彭宣宪,王三英;日本对虾血清三类免疫球蛋白样物质的研究[J];海洋科学;2001年05期
9 彭宣宪,吴兰,胡克平,李思光;用ELISA法测定SPA与多种动物IgG的结合特性[J];江西科学;1992年04期
10 夏春,青柳宙,中西照幸;一新MHCⅠ类等位基因存在于低等脊椎动物虹鳟鱼[J];科学通报;2001年02期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 陈玉栋;病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王传娟;大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究[D];中国海洋大学;2007年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 江育林,李正秋;病毒感染的草鱼细胞产生类干扰素物质的研究[J];病毒学报;1991年01期
2 邵健忠,项黎新,李亚南,毛树坚;从草鱼细胞分离到一种抗出血病病毒蛋白因子的研究[J];病毒学报;1993年04期
3 贾方钧,王铁辉,张义兵,俞小牧,李戈强;干扰素防治草鱼出血病的效果初探[J];水产科学;2000年04期
4 陈敏容,陈宏溪,易詠兰;鲫鱼异倍体细胞系的建立及生物学特性[J];水产学报;1985年02期
5 闵淑琴,洪世雯,蔡宜叔;鱼呼肠孤病毒(FRV)抗血清的制备及其应用[J];水产学报;1986年04期
6 张义兵,王铁辉,李戈强,贾方钧,俞小牧;鲫鱼囊胚细胞干扰素的诱导及部分特性[J];中国病毒学;2000年02期
7 张义兵,桂建芳;干扰素诱导的鱼类Mx蛋白[J];中国病毒学;2001年04期
8 张义兵,俞小牧;鱼类干扰素的研究进展[J];中国水产科学;2000年03期
【相似文献】
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1 杜昌升;牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2005年
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