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《中国科学院研究生院(水生生物研究所)》 2007年
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三种养殖鱼类抗病毒免疫的初步研究

吕爱军  
【摘要】: 鱼类病毒性疾病频繁发生,研究鱼类免疫学是寻找有效抗病及防病途径之一。弹状病毒与虹彩病毒是危害鱼类的两大类重要病毒病原。因此,我们针对鲆弹状病毒(Scophthalmus maximus rhabdovirus, SMRV)及蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV),分别选择牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)等进行鱼类的抗病毒免疫相关研究,主要结果如下: 1.从灭活SMRV诱导的牙鲆囊胚细胞(Flounder embryo cells, FEC)差减cDNA文库中获得VDAC EST片段,进一步通过RACE-PCR技术从SMART-cDNA文库中克隆、鉴定了牙鲆电压依赖性阴离子通道基因(Paralichthys olivaceus voltage-dependent anion channel, PoVDAC)的全长cDNA序列。PoVDAC基因cDNA长1380 bp,最大开放阅读框(open reading frame, ORF)长852 bp,编码283个氨基酸,推测PoVDAC蛋白包括一个α螺旋,13个跨膜β折叠结构和一个真核生物线粒体孔蛋白标签序列。利用Real-time PCR分析表明,PoVDAC基因在牙鲆各组织中具有表达,在心脏、肌肉和鳃中丰富表达,经SMRV病毒诱导FEC细胞PoVDAC的表达水平升高。Western blot分析表明PoVDAC在牙鲆组织中主要形成32 kDa单体蛋白,应用草鱼抗VDAC血清在牙鲆心脏提取液中能够检测到32 kDa蛋白带。PoVDAC在鱼类细胞中过量表达能诱导细胞凋亡,而且在病毒诱导FEC细胞凋亡中PoVDAC分布发生明显变化,提示PoVDAC可能通过诱导细胞凋亡介导牙鲆抗病毒免疫反应。 从差减cDNA文库中获得牙鲆钙调素基因(Paralichthys olivaceus calmodulin,PoCaM),设计特异引物扩增并克隆了PoCaM cDNA。计算机辅助分析表明,PoCaM基因编码149个氨基酸的推定蛋白,其分子量为17 kDa,等电点为3.93,含有4个螺旋-环-螺旋样结构,与其它鱼类CaM氨基酸一致性为97.3-100%。构建原核表达重组质粒pET32a/PoCaM,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳,结果显示PoCaM在大肠杆菌中进行了特异性融合表达,融合蛋白分子量约为32kDa,与预期分子量大小一致。同时,以绿色荧光蛋白(GFP)为表达标签,构建真核表达重组质粒pEGFP-N3/PoCaM,分别转染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、肥头鲤(Fathead minnow, FHM)和FEC细胞,荧光显微镜观察显示,PoCaM在鱼类细胞中进行瞬时表达,主要分布于细胞核及胞质内。 此外,经SMRV病毒诱导的牙鲆皮肤培养上清液中存在抗SMRV特异性抗体,而且牙鲆皮肤可以持续分泌抗体达20周以上。 2.以SMRV、RGV病毒为腹腔注射免疫原,分别免疫接种草鱼;进一步通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)等现代免疫学技术,对草鱼血清及皮肤培养上清液中的抗体水平进行检测。iELISA检测结果表明,草鱼抗SMRV血清的抗体效价(1:1458)明显高于皮肤培养上清液的抗体效价,后者仅为1:12。Western blot分析表明,草鱼抗血清及皮肤培养上清液中抗体能识别SMRV的磷酸化蛋白(Phosphoprotein, P)和基质蛋白(Matrixprotein, M)病毒抗原。IFA结果显示,在SMRV病毒感染EPC细胞的病毒装配区有荧光信号。进一步用流式细胞术(FCM)分析SMRV病毒感染36h的EPC细胞,可以检测4.39%的病毒感染细胞,而对照细胞非特异性反应为2.0%。 此外,iELISA检测结果表明,经腹腔注射RGV病毒诱导的草鱼皮肤培养上清液中存在特异性抗RGV抗体成分。Western blot分析显示,兔抗草鱼IgM多克隆抗体主要识别草鱼抗RGV血清中IgM的重链(88 kDa)和轻链(21 kDa)蛋白分子。分别用鱼抗RGV血清及皮肤培养上清液进行IFA结果显示,在RGV病毒感染EPC细胞核附近的胞质区有荧光信号。以上结果提示草鱼的皮肤粘液免疫在抗病毒感染中可能起重要功能。 3.采用微量细胞病变(CPE)抑制法检测结果表明,未诱导的赤点石斑鱼皮肤培养上清液对SMRV和RGV病毒有一定的非特异性抑制作用;经56℃30min处理仍有抗病毒活性,提示皮肤上清液中存在非热依赖性抗病毒物质。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(水生生物研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S941

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【参考文献】
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