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《中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)》 2019年
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肝癌治疗siRNA脂质纳米载体的设计及其高效递送机制的研究

何淑芳  
【摘要】:我国每年新增肝癌患者达35万,约占全球新增病例的一半。临床中,大部分诊断发现的肝癌已处于中晚期,需要接受药物治疗。传统的阿霉素、氟尿嘧啶等细胞毒类抗肿瘤药物在临床治疗肝癌时存在选择性低、毒副作用严重以及耐药性等问题。近年来兴起的基于小干扰RNA(small interferenceRNA,siRNA)的基因治疗技术可以特异性高效沉默特定致癌基因的表达,能够用于恶性肿瘤的治疗。裸露的siRNA十分不稳定,易被血清中的核酸酶降解。此外,其分子量大、亲水性强且荷负电的特性,导致其无法直接穿过细胞膜,需要借助纳米载体进行体内递送。在各种siRNA递送载体中,非病毒载体由于具有良好的安全性而备受青睐。近年来,虽然有络绎不绝的siRNA类药物进入临床试验,但是绝大部分的药物受阻于Ⅰ-Ⅱ期。直至2018年8月,全球首个siRNA药物Onpattro被美国FDA批准上市,成为siRNA类药物正式走向临床应用的里程碑。据siRNA类药物的临床试验报告可知,限制siRNA类药物临床转化的两大最主要因素是其体内的siRNA递送效率及脱离靶组织问题。随着近年来siRNA递送载体的快速发展,目前而言,siRNA递送载体的高效性主要取决于其克服细胞屏障的能力,而解决脱离靶组织问题则主要依靠其肿瘤靶向能力和消除脱离靶组织后副作用的能力。对此,本文设计并构建了两种新型的基于脂质的siRNA递送系统,用于实现siRNA的高效递送并解决其脱离靶组织问题。针对提高siRNA递送效率并消除脱离靶组织后副作用的问题,本文首先设计并构建了一种具有相转变性能的脂质液晶纳米粒用于高效克服siRNA递送过程中的细胞屏障,同时利用合成致死效应消除了纳米载体脱离靶组织后的副作用。该脂质液晶纳米粒具有良好的血清稳定性及促细胞摄取的能力。被细胞摄取进入内涵体后,该脂质液晶纳米粒可在内涵体酸性环境下利用其组成分子的水解性能发生相转变,该相转变过程可以进一步促使其与内涵体膜发生高效的膜融合并高效释放内容物。此外,该脂质液晶纳米粒是利用siRNA的水溶性对其进行包载的,自身不具有强正电性。因而,在进行内涵体膜融合时,该脂质液晶纳米粒可以快速与siRNA完成解离并直接将游离的siRNA分子递送进入细胞质当中,最终克服细胞屏障并实现siRNA的高效递送。此外,我们以CDK1-siRNA(cyclin-dependent kinase 1-siRNA)作为治疗药物,利用其与肝癌之间的合成致死关系,分别在细胞水平和动物水平实现了高效的CDK1基因沉默,显著性抑制HepG2肝癌细胞的增殖及其异位移植瘤的生长,且不对肝永生化细胞产生影响。我们利用该种新型脂质液晶纳米粒的相变性能巧妙地解决了大部分基于脂质的siRNA递送载体所面临的递送效率低及脱离靶组织后副作用的问题。但是,由于脂质液晶纳米粒的表面未经任何修饰,仍然存在肿瘤靶向性差的缺陷,无法全面解决纳米载体的脱离靶组织问题。对此,本文设计并制备了脂质杂合型外泌体囊泡,以期在实现siRNA高效递送以及消除脱离靶组织后副作用的基础上,进一步提高纳米载体对肿瘤的靶向性,全面克服siRNA纳米载体的脱离靶组织问题。该杂合型外泌体囊泡是以肝癌细胞Sk-hepl来源的外泌体为基础,依次经破膜、反复离心去除内容物、并与DPPC(Dipalmitoylphosphatidylcholine)磷脂杂合得到的。其中,外泌体膜的应用可以使脂质杂合型外泌体囊泡继承外泌体天然的核酸递送行为及其“归巢”性能,而加入DPPC磷脂进行杂合则可以提高囊泡的稳定性。该脂质杂合型外泌体囊泡可以通过电穿孔的方式实现对siRNA的高效包载及保护,且具有卓越的稳定性和安全性。通过巨噬细胞对脂质杂合型外泌体囊泡的摄取以及炎症因子检测的实验,说明了脂质杂合型外泌体囊泡在体内的长循环以及克服血液清除的能力;脂质杂合型外泌体囊泡在小鼠体内的组织器官分布结果则说明了其在肿瘤部位良好的“归巢”靶向性。进一步对脂质杂合型外泌体囊泡的胞内命运进行研究,结果显示,其在进入母细胞的内涵体后的命运与外泌体几乎一致,可经胞内囊泡分选途径被递送至高尔基体中,有效避开溶酶体途径对递送载体及siRNA的降解。最后,我们同样以包载了 CDK1-siRNA的脂质杂合型外泌体囊泡在细胞水平、动物水平的基因沉默效率及抗肿瘤药效学进行了评价。结果显示,经由脂质杂合型外泌体囊泡递送的CDK1-siRNA在细胞水平及动物水平均具有生物学活性,可以有效沉默CDK1基因的表达,在展现出显著的抗肿瘤效果的同时对正常的肝细胞及组织不具有毒性。至此,本文针对非病毒siRNA递送载体存在的递送效率低及脱离靶组织问题,依次设计并制备了脂质液晶纳米粒和脂质杂合型外泌体囊泡实现了 siRNA的高效递送并克服了 siRNA递送载体的脱离靶组织问题,并最终实现了肝癌的安全高效治疗。本文为基于脂质的siRNA递送系统的合理设计提供了新思路和新方法,为siRNA类药物用于肝癌治疗的临床转化提供了新的可能。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R943

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