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甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的分子进化及功能研究

牛国栋  
【摘要】: 本论文由四章组成。 第一章对杆状病毒及泛素系统的研究作了简要的论述。首先从杆状病毒的基础和应用研究两个方面进行了综述,然后单独总结了甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodptera exigua Multi Nucleocapsid Nucleopolyhedrovirus, SeMNPV)最近的研究进展,最后对泛素系统进行了阐述。 第二章进行了SeMNPV泛素基因的原核表达和序列分析的研究。该基因编码区全长243bp,编码80个氨基酸,预计蛋白质分子量为9.4kD。将这一ubiquitin基因克隆到原核表达载体pET-28a上,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行了优化,并且用特异性的抗体进行了检测。对不同来源的泛素进行了同源性分析,与真核细胞中的泛素相比较,杆状病毒泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的泛素基因在分子进化上可能有比较独特的途径。 第三章介绍了SeMNPV宿主甜菜夜蛾的一个泛素同源基因。从甜菜夜蛾幼虫中用3'RACE-PCR技术得到了一个新的泛素延伸基因,并对其进行了序列分析和原核表达。根据已知的草地夜蛾(Spodptera frugiperda)的ubiquitin extension gene 5'端核苷酸序列设计引物,应用3'RACE-PCR技术,从甜菜夜蛾脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长513bp,3'末端有123bp的非翻译区(UTR),翻译区编码一个长为129个氨基酸的蛋白质,预测分子量为14.8kD。同源分析表明,此cDNA为ubiquitin 53aa extension gene(ubi53),在该基因的编码蛋白在泛素后融合了一个核糖体L40蛋白(Ribosomal L40 protein)。将甜菜夜蛾的ubi-53基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,用异源泛素单克隆抗体进行Western blot检测,证明了 WP=8 原核表达蛋白是目的蛋白。 第四章报道了利用酵母双杂交系统研究SeMNPV的Ubiquitin分别和抗细胞凋亡蛋白IAP2,IAP3在体外的相互作用。实验表明,用Clontech 公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,只在低严谨型筛选培养基上得到了一些阳性克隆,这说明Ubiqutin和IAP2, IAP3在体外可能存在着较弱的相互作用,这种相互作用也可能是因为Ubiqutin和IAP利用了酵母中本身存在的E1和E2。 需要 进一步证明SeMNPV的Ubiquitin和E1,IAP和E2有直接相互作用。


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