含增效蛋白重组棉铃虫病毒的构建及活性分析

【摘要】： 杆状病毒是多种有害昆虫的病原体，如今已经有多种杆状病毒被用来防治农业、蔬菜、森林和牧场的害虫。然而，由于杆状病毒杀虫速度慢，对高龄幼虫活性低，杀虫谱窄等方面的缺陷，限制了它的进一步推广。为了克服这些缺点，已经有多种遗传改良措施被应用于新型杆状病毒杀虫剂的研制。这里我们构建了含黄地老虎颗粒体病毒(AgseGV)的增效蛋白基因的重组棉铃虫核型多角体病毒(HearSNPV)，以增强其感染性。另外，我们还构建构建了一个含有棉铃虫中肠P450基因490bp的正向和反向片段的质粒，该质粒将用来构建对棉铃虫P450基因表达进行干扰的重组病毒。 第一章：由四个部分组成：第一部分概括介绍了杆状病毒生物学、分子生物学研究进展和应用研究情况；第二部分简单介绍了杆状病毒增效蛋白的发现、特性以及应用；第三部分主要叙述了昆虫P450基因的作用及其和昆虫抗性之间的关系；最后，概述了RNAi的分子机制和其生物学功能。 第二章：已经在多种杆状病毒中鉴定了编码增效蛋白(Enhancin)的基因，Enhancin是一种金属蛋白酶，能够增强杆状病毒和苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫的感染性。我们对AgseGV的Enhancin基因进行了克隆、测序和生物信息学分析。序列分析结果表明，AgseGV的Enhancin基因编码1004个氨基酸，预测的蛋白大小为115kDa，该蛋白包含了一个金属蛋白酶类特有的锌指结合区域(HVMGH)。AgseGV增效蛋白与其它已发现的增效蛋白有大约25％的蛋白一致性。利用棉铃虫的Bac-to-Bac系统，分别构建了回复HearSNPV多角体蛋白(polyhedrin)基因的重组病毒HearBacPolh和含有AgseGV增效蛋白同时回复HearSNPV多角体蛋白的重组病毒HearBacPolhEn。生物活性测定结果表明，HearBacPolhEn与野生型病毒HearSNPV及对照病毒HearBacPolh对3龄棉铃虫幼虫的半数致死剂量(LD_(50))没有显著性差异。本章对AgseGV的Enhancin没有增加HearSNPV的感染性的现象进行了讨论。 第三章：双链RNA介导的RNAi是近年来发展起来的一种新兴的用于研究基因功能的有力工具，用来研究线虫、植物、昆虫的基因功能。我们将棉铃虫中肠P450基因一个490bp片段的正向和反向克隆进入pFastBacDual中，同时将EGFP基因引入该质粒，获得重组质粒pFastBacCYP-EGFP。该质粒将被用来构建在感染宿主细胞或者昆虫后能够形成长链发夹结构的双链RNA的重组病毒，以期对P450基因的表达进行干扰。