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《中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)》 2007年
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家蚕核多角体病毒Bac-to-Bac系统的构建及Bm21的功能分析

黄金山  
【摘要】: 本论文构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的Bac-to-Bac系统,在此基础上构建失活chitinase与v-cathepsin的Bac-to-Bac系统;并运用bacmid系统,对BmNPV的orf21进行功能研究,论文包括四个章节: 第一章以综述的形式扼要介绍了杆状病毒的分类特征、基因组结构、病毒复制周期、致病的分子机制及杆状病毒的应用,重点介绍了杆状病毒表达载体的研究现状及应用,详细阐述了BmNPV的分子生物学研究及家蚕杆状病毒表达载体的研究与应用。 第二章详细介绍了BmNPV的Bac-to-Bac系统的构建过程。成功地将含有一个Mini-F复制子、Kanamycin抗性基因、lacZ基因以及attTn7转座插入位点的8.6 kb的DNA片段置换到BmNPV基因组中的多角体基因位点,构建了能在大肠杆菌中稳定遗传的BmNPV bacmids,获得了17株不同的基因型,分别命名为BmBacJS1至BmBacJS17。将polyhedrin基因回复到与野生型BmNPV具有相似的限制性内切酶图谱的BmBacJS13中并进行了体内和体外感染性实验。实验结果表明BmBacJS13是一株具有与野生型病毒相同感染特性的bacmid。为了进一步分析BmBacJS13表达外源蛋白的性能,将egfp基因转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点,重组病毒感染细胞和幼虫后在细胞水平和虫体水平都观察到了强烈的绿色荧光。表明我们已成功构建了一套能在体内和体外表达外源基因的BmNPV Bac-to-Bac系统。 第三章对己构建的BmNPV Bac-to-Bac系统进行改良,以期提高此系统的外源基因的表达效率。利用DNA同源重组技术在大肠杆菌中用氯霉素抗性基因替代BmBacJS13中的chitinase和v-cathepsin编码区域,获得了两基因同时失活的重组bacmid—BmBacJS13ACC。将AcMNPV几丁质酶信号肽与报告基因luciferase融合,转座到BmBacJS13和BmBacJS13ACC,构建重组病毒BmBacJS13ACC-luc与BmBacJS13-luc,比较两者对外源基因的表达量的影响。结果显示:无论是分泌到胞外的还是整个细胞的Luciferase的产量,BmBacJS13ACC-luc都显著高于对照病毒,表明改造后的BmBacJS13ACC是一个更有效的表达载体。 第四章利用所构建的Bac-to-Bac系统对BmNPV orf21(Bm21)的功能进行分析。Bm21预测编码55.8kDa的蛋白,RT-PCR分析显示Bm21基因的转录产物在感染后12小时检测到,并持续到感染末期,而BM21的表达在感染后36小时可以检测到;将BM21的C端与EGFP融合瞬时转染BmN细胞,显示其定位于细胞核中,病毒超感染后其定位没有发生改变。为了进一步分析其功能,运用九噬菌体Red重组系统构建了缺失Bm21的重组病毒。结果表明对照病毒与缺失病毒之间BV的生长曲线和LC_(50)无明显差异,而缺失病毒的ST_(50)比对照病毒有8小时的延长,且差异达到了显著程度。因此Bm21是病毒复制的非必需基因,但可以加速感染虫体的死亡时间。
【学位授予单位】:中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q939.4

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