海产诺如病毒（norovirus）检测和养殖水体生物修复研究

【摘要】： 诺如病毒污染和抗生素残留超标是海产食品中两大新的安全问题。(1)诺如病毒(norovirus，NV)是世界范围内的急性病毒性胃肠炎的主要病因，海产环境中的水和贝类是其主要传播载体。由于环境中病毒含量很低，因此迫切需要建立一种灵敏的标准化检测方法。(2)抗生素残留超标源自为了控制由水质恶化导致的疾病而过量使用抗生素，生物修复是解决这一问题的关键。本论文针对这些问题进行了持续研究，取得了良好进展。 1、研究了从水体中浓缩病毒的钙离子絮凝法。首先利用CaCl_2和Na_2HPO_4絮凝病毒，然后用柠檬酸缓冲液洗溶，之后进行RT-PCR。该方法可检出1个RT-PCRU的NV，其灵敏度较传统的吸附-洗脱-浓缩三步法要高至少5倍， 2、建立了一项贝类中诺如病毒(norovirus，NV)检测的标准化方法SN／T1635-2005。该方法是用GPTT程序提取病毒和纯化病毒RNA，用引物JV12／JV13进行普通RT-PCR，用COG1F，COG1R，RING1(a)-TP，RING1(b)-TP和COG2F，COG2R，RING2-TP分别检测GⅠ和GⅡ型NV。 3、海产诺如病毒污染调查结果表明，在采集的海水样品中检出了NV(阳性率1／15)，同时还在贝类(文蛤)样品中也检出了NV(阳性率1／20)，说明海水污染与贝类污染之间有一定的联系，人类粪便排放不当会造成贝类中NV污染。 4、研制了一种生物修复菌的富集新方法，即直接向海水样品中添加1g／LNaHCO_3和3g／L CH_3COONa的方法，分离得到了一株高效生物修复菌-光合细菌W1。该菌经形态学和生理特性研究，被鉴定为沼泽红假单胞菌(Rhodopuesdomonas pulstris)。 5、采用正交法试验优化得到了光合细菌的计数培养基—R培养基，在此基础上建立了一种光合细菌活菌计数方法—半固体试管法。用此法检测W1菌的培养物，发现其活菌密度为2.8×10~9cfu／mL。 6、W1菌的生物修复作用是通过其活菌体来实现的。通过菌体合成和脱氮作用，W1促进了养殖环境中碳、氮的良性循环。W1对其它微生物如普通需氧菌、弧菌、噬菌体等没有抑制作用。微生物抑制法试验也证实了W1不产生抗生物质。通过对虾池水质净化试验对W1的生物修复作用进行研究，发现施用W1后，实验期间氨氮全程在0.6 mg几以下，CODcr降低了29％，DO增加了27％，pH值稳定在7.7-7.8之间，水质得到了较好的改善，对虾的收获量也增加了6.25％。固定化W1菌剂对文蛤养殖场水质有较好的调控作用，并能促进文蛤的生长。 对诺如病毒造成的急性胃肠炎目前尚无特效药治疗，而抗生素在海产养殖中的泛滥使用带来了严重的食品安全问题。本项研究通过建立快速、简便、灵敏的检测方法和标准，可用于快速检测海产食品的污染状况，对于阻断病毒传播和预防及控制由诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发具有十分重要的意义，并对其它食源性病毒的检测与控制也有较大的参考价值。另外，通过揭示W1菌生物修复作用的机理，建立起可用于海水养殖的生物修复方法，为解决海产食品抗生素残留超标的问题提供了可行的途径，对于保障食品安全和促进海产养殖的可持续发展有重要作用。