MiR396在烟草中的功能分析

【摘要】：植物MicroRNAs (miRNAs)是由具有发夹结构的单链RNA前体(约70-90个碱基大小)经过Dicer-like酶加工后生成的具有调控功能且大小约21个碱基的小分子RNA。MiR396是Jones-Rhoades等于2004年首先在拟南芥中发现的,同时通过5'RACE证实了部分AtGRF基因家族成员(AtGRF1、AtGRF2、AtGRF3、AtGRF7、AtGRF8、AtGRF9)是miR396的靶基因。EST序列分析发现miR396在15个不同的物种中存在,是高度保守的小分子,并且其初始转录体和成熟的miRNA都具有高度保守性,特别是成熟miRNA序列及其互补序列,这表明miR396可能在植物发育方面具有重要且保守的功能。利用其高度保守性,本研究通过在烟草中高表达拟南芥miR396来分析miR396在烟草中的功能。 用拟南芥miR396a互补序列做探针,通过Northern杂交检测后,发现烟草中有很高的miR396的表达水平,也证实了烟草中miR396的存在。我们采用基因克隆的方法将拟南芥miR396前体a重组为高表达质粒35S::AthMIR396a)后,通过农杆菌侵染叶片法获得转基因烟草。miR396的高表达转基因植株中,miR396的表达量比对照明显增强,经观察发现miR396高表达转基因烟草植株矮化且叶片变窄,花发育异常,这些与本实验室之前的研究结果,即miR396通过负调控AtGRF1-AtGRF3来调控叶的形态发育导致高表达miR396的拟南芥转基因植株矮化且叶片变窄相一致。通过搜索烟草EST数据库,我们得到四个与AtGRF高度同源并具有WRC保守域的EST序列)GenBank Ace:FG137771, FG165999, FG167390和FG194560),同时他们都含有与miR396互补序列,由此我们推测它们为miR396在烟草中潜在的靶基因。RT-PCR分析结果表明高表达转基因烟草中除了FG167390外其余三个EST序列的mRNA水平明显降低,从而证实了我们的假设,即miR396在烟草中负调控NtGRF-like基因。 MiR396受干旱诱导表达,同时miR396也可以提高烟草的耐旱性。MiR396高表达转基因植株矮小,叶变窄,是耐旱植物的典型特征。野生型和转基因植株在相同的环境生长8周后,进行干旱处理3周。结果发现35S：：MIR396a转基因植株仍能正常生长且比三周前有明显长高,而野牛型已完全萎蔫。用10%PEG6000处理3周大幼苗4小时也得到同样的结果。为了阐明miR396提高拟南芥抗旱性的机制,我们分别测定了高表达和对照植株的失水率和相对含水量,发现高表达植株有更强的保水能力。通过激光共聚焦扫描叶下表皮,发现miR396高表达转基因植株叶的气孔密度降低。由于大部分水分是通过气孔扩散的,且通过气孔的蒸腾量一般可达与叶面积相同的自由水面蒸发量的50%,甚至可达100%,所以气孔密度降低会提高拟南芥的保水能力,有利于拟南芥在干旱环境下生长。 另外我们检测了小分子在植物体内的传递,发现将高表达miR396的转基因烟草植株去顶接上野生型嫩芽,生长4周后野生型嫩芽新生的叶片中的miR396表达量提高；而将野生型植株作为砧木上接高表达miR396的转基因嫩芽生长4周后,野生型砧木新生的侧枝嫩叶中miR396表达量无明显变化,说明miR396能延茎轴方向向上传递而不能往下运输。 综上所述,miR396可以通过负调控NtGRF-like来调控叶的形态发育；miR396提高拟南芥的抗旱性是由于miR396高表达导致植株矮化、叶变窄、气孔密度降低；同时我们检测到miR396能延茎轴方向向上传递,暗示miR396可能参与依赖韧皮部运输的信号传导。