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拟南芥WRKY25和At2g03440编码的结瘤相关蛋白抗热功能分析

付乾堂  
【摘要】:高温胁迫对植物造成损伤并诱导植物产生热激反应,是限制植物生长和地域分布的重要影响因子之一。本研究通过高温胁迫下的基因表达谱分析,筛选到受高温诱导的WRKY25和受高温明显抑制编号为At2g03440的基因,并通过筛选这两个基因的突变体和构建高表达转基因植株,进一步分析它们抗热方面的分子生物学功能。 (1)WRKY25的表达受高温胁迫的明显诱导,并随处理时间的延长表达持续增强。通过对筛选到的wrky25与野生型材料的不同生长阶段在高温处理后的比较分析发现:wrky25相对野生型材料表现出对高温的敏感性,如高温处理后下胚轴的伸长、根的伸长和成苗期高温处理后的电导率增加等。 WRKY25高表达转基因植株在正常条件下苗的状况和生长势比野生型材料要明显弱一些,不易进行抗热比较分析;但WRKY25高表达转基因植物的种子在高温处理后的萌发率明显比野生型材料高,表现了一定的高温抗性。 对一些热胁迫相关的标志基因进行表达分析,如热激转录调控因子HsfA2、HsfB1和氧化反应相关的基因APX2,Zat10和热激蛋白Hsp101等在高温处理后的突变体和野生型材料中的表达分析。结果表明,虽然作为热激因子的HsfA2在突变体和野生型材料的表达差异相对微弱一些,但HsfB1,HSp101,APX2,Zat10在wrky25突变体中的表达量都要比对应处理温度的野生型材料的表达量要低,尤其以42℃处理1h差别更明显。WRKY25在抗高温的作用可能涉及与这些抗热相关的热激因子、热激蛋白基因和氧化胁迫相关基因的相互表达调控。 (2)编号为At2g03440的基因功能还未见报道,生物信息学分析由At2g03440编码的蛋白与苜蓿早期结瘤蛋白12B前体(Early nodulin 12B precursor)有一定程度的相似性,我们就暂命名“结瘤相关蛋白1"(Nodulin-related protein 1,NRP1)。本论文从AtNRP1组织表达定位、逆境胁迫下的表达谱初步分析AtNRP1可能的功能。 对ProAtNRP1::GUS转基因植株不同发育时期和不同器官进行组织化学GUS染色,发现AtNRPl基因主要在幼苗期大部分组织,成苗期生长旺盛的顶端分生组织和在花器官中的雄蕊、柱头表达强烈,此外AtNRP1在剪伤的伤口部位和愈伤组织中都有很强的表达。AtNRP1在不同逆境胁迫下的表达谱分析表明AtNRP1受高温和ABA的明显抑制,受低温的强烈诱导和NaCl轻微诱导,而自然干旱和H20处理则对AtNRP1无明显影响。AtNRP1高表达转基因株系在高温胁迫处理后表现出比野生型对高温敏感,而在高温处理后的nrpl与野生型相比则无明显差别,推测单个基因的突变,尤其是下游功能基因的突变可能由于相似功能的基因互补而不易产生明显的表型。 我们首先检测了重要的热激相关的转录调控因子HsfA2、MBF1c和常见的热激蛋白Hsp70、Hsp101的表达是否在高温处理后的AtNRPl高表达转基因植株、野生型和nrpl突变体植株中存在差异。结果表明这几个热诱导的基因在AtNRP1高表达、突变体和野生型植株中的表达量无明显的差异,我们推测AtNRP1在抗热方面的作用可能不是依赖热激因子、热激蛋白这条抗热途径,可能是有另外的信号途径参与。 基于对ABA处理后AtNRPl的表达谱分析,我们检测了高温处理AtNRPl高表达转基因植株、nrpl和野生型植株后检测内源ABA的含量,结果表明38℃热处理约30min后,每个材料中ABA的含量都急剧增加,并随着热处理时间的延长,ABA的积累继续呈增加趋势,但高表达株系积累的ABA量都低于野生型和突变体材料的,推测AtNRP1在抗热反应中的作用与ABA的积累有关。此外,进一步的Northern杂交表明AtNRPl基因在野生型材料中受高温因子的抑制,而这一抑制情况在热处理的aba2-3材料中没出现,随着高温处理时间的延长,NRP1的表达在aba2-3中无明显变化。我们推测外源ABA抑制AtNRPl基因的表达,而高表达AtNRP1对热处理后的ABA的积累是一个负反馈调控作用,AtNRP1在抗热方面的作用可能是通过调控ABA信号途径而实现。


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