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《中国科学院教育部水土保持与生态环境研究中心》 2017年
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夏枯草迷迭香酸生物合成途径酪氨酸支路关键酶基因的克隆与功能研究

汝梅  
【摘要】:夏枯草(Prunella vulgaris L.)为多年生唇形科夏枯草属植物,因“夏至后即枯”而得名。其以干燥的果穗入药,系我国传统大宗药材之一,味辛、苦,性寒,归肝、胆经,主要成分有迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、齐墩果酸、黄酮类物质、矢车菊素、挥发油等,具有缓解咽喉肿痛、清热明目、加速伤口愈合等作用。2015版《中国药典》规定夏枯草以干燥品计算,迷迭香酸含量不得低于0.2%。目前,对于夏枯草中迷迭香酸生物合成途径的酶的信息知之甚少,故对夏枯草迷迭香酸代谢途径酪氨酸支路关键酶基因进行克隆和功能验证,并进一步利用植物代谢工程的手段来提高夏枯草中迷迭香酸的含量,具有极为重要的理论和现实意义。本文主要采用同源克隆的方法克隆了夏枯草迷迭香酸生物合成途径酪氨酸支路上的酪氨酸氨基转移酶基因(PvTAT,KM053278)和对羟基苯丙酮酸还原酶基因(PvHPPR,KM053279),在分析其生物信息学的基础上,从组织表达分析和诱导子诱导分析、蛋白的亚细胞定位、原核蛋白表达及体外酶动力学活性检测、体内酶功能互补、过表达和反义表达目的基因诱导转基因毛状根方面着手,确定其体内和体外酶活活性,进而解析转基因毛状根株系中基因表达量、酶活、迷迭香酸含量三者之间的关系,最终阐明该酶在夏枯草迷迭香酸合成途径中的作用,得到主要结果如下:1.PvTAT的开放阅读框序列长1,236-bp,编码411个氨基酸,预测分子量45.1 kDa,等电点5.97;基因组序列长2,634-bp,含有7个外显子,6个内含子。PvTAT保守结构域具有典型的酪氨酸催化位点和PLP结合位点,归属于PLP依赖的天冬氨酸氨基转移酶超家族,依据Panther classification system归类系统,其亦属于酪氨酸氨基转移酶亚家族。PvHPPR的开放阅读框序列长942-bp,编码313个氨基酸,预测分子量34.1 kDa,等电点5.58;基因组序列有两个,分别长2,215-bp和1,718-bp,两者均含有2个外显子和1个内含子,大片段的内含子序列比小片段的多了497-bp。基因组步移得到其上游序列2,273-bp,启动子序列中含有响应光、水杨酸、环境胁迫、调控生长发育和初生代谢有关的作用元件。PvHPPR保守结构域具有典型的NAD(P)H结合区域和精氨酸、谷氨酸、组氨酸催化位点,归属于2-羟基酸脱氢酶家族。2.qRT-PCR表明PvTAT和PvHPPR在盛花时期根中的相对表达量最高,叶中次之,两者的表达均受外源的水杨酸和乙烯信号的调节。3.通过在PvTAT和PvHPPR的C-端融合GFP蛋白,将其在烟草中瞬时表达,用激光共聚焦显微镜观察烟草的原生质体发现PvTAT定位在细胞质中;观察烟草叶片发现PvHPPR与内质网marker共定位,PvHPPR定位在内质网中。4.PvTAT能够功能互补酪氨酸营养缺失突变体大肠杆菌DL39,使其恢复生长;原核表达PvTAT,重组蛋白的分子量~65 kDa,体外酶活测定表明,PvTAT具有酪氨酸氨基转移酶活性,并且正向反应比反向反应的酶活活性更高,对酪氨酸和苯丙酮酸的亲和性最高,Km值分别是0.40 mM和0.48 mM。原核表达PvHPPR,重组蛋白PvHPPR的分子量~47 kDa,体外酶活测定表明,PvHPPR具有使4-羟基苯丙酮酸、苯丙酮酸、丙酮酸还原成相应的乳酸盐的能力,NADH和NADPH均可作为其辅因子,对NADPH的亲和性更高;对4-羟基苯丙酮酸的亲和性比对苯丙酮酸与丙酮酸的亲和性要高,对应的Km值分别是0.31、0.73、1.02 mM。5.在夏枯草毛状根中分别过表达和反义表达PvTAT,反义表达PvTAT使其表达量降低了46–95%,酶活随之降低,迷迭香酸的含量降低了36–91%;相反,过表达PvTAT使其表达量升高了0.77–2.6倍,酶活随之升高,迷迭香酸的含量升高了1.3–1.8倍。相关性分析结果显示:夏枯草毛状根中PvTAT的表达量、TAT的活性、迷迭香酸的含量三者间存在显著的正相关性,表明该酶参与夏枯草中迷迭香酸的生物合成。在夏枯草毛状根中过表达PvHPPR,使其表达量升高了0.7–9.7倍,迷迭香酸的含量升高了24–63%。相关性分析结果显示:夏枯草毛状根中PvHPPR的表达量与迷迭香酸的含量存在显著的正相关性,表明该酶参与夏枯草中迷迭香酸的生物合成。6.获得了迷迭香酸含量较高的毛状根株系,迷迭香酸含量比原植物中高了近10–30倍。
【关键词】:夏枯草 迷迭香酸 酪氨酸支路 酪氨酸氨基转移酶 对羟基苯丙酮酸还原酶
【学位授予单位】:中国科学院教育部水土保持与生态环境研究中心
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S567.239
【目录】:
  • 致谢4-5
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-12
  • 缩略词12-14
  • 第1章 绪论14-40
  • 1.1 选题的背景及意义14-15
  • 1.2 国内外次生代谢领域的发展现状15-38
  • 1.2.1 植物次生代谢物15-18
  • 1.2.2 植物代谢工程18-27
  • 1.2.3 迷迭香酸生物合成途径27-28
  • 1.2.4 迷迭香酸生源途径关键酶的研究进展28-36
  • 1.2.5 迷迭香酸的体外培养36-37
  • 1.2.6 夏枯草迷迭香酸代谢途径的研究进展37-38
  • 1.3 研究内容与技术路线38-40
  • 1.3.1 研究内容38-39
  • 1.3.2 技术路线39-40
  • 第2章 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的克隆与功能研究40-92
  • 2.1 试验材料41-44
  • 2.1.1 植物材料41
  • 2.1.2 载体与菌株41
  • 2.1.3 主要试剂41-42
  • 2.1.4 DNA的提取与感受态细胞的制备42-43
  • 2.1.5 主要仪器设备43-44
  • 2.2 试验方法44-68
  • 2.2.1 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的克隆与分析44-49
  • 2.2.2 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的组织表达分析49-50
  • 2.2.3 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的表达分析50
  • 2.2.4 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的亚细胞定位分析50-56
  • 2.2.5 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的原核表达及酶活检测56-62
  • 2.2.6 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的功能互补研究62-64
  • 2.2.7 过表达和反义表达夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的遗传转化64-68
  • 2.2.8 数据分析68
  • 2.3 结果与分析68-88
  • 2.3.1 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的克隆与序列分析68-72
  • 2.3.2 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT的表达分析72-74
  • 2.3.3 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的亚细胞定位分析74-76
  • 2.3.4 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的原核表达及酶活检测分析76-81
  • 2.3.5 夏枯草酪氨酸氨基转移酶PvTAT的功能互补研究81-84
  • 2.3.6 夏枯草酪氨酸氨基转移酶基因PvTAT在转基因毛状根中的过表达及反义表达分析84-88
  • 2.4 结论与讨论88-92
  • 2.4.1 PvTAT属于PLP依赖的天冬氨酸氨基转移酶家族88-89
  • 2.4.2 体外酶活检测证明了PvTAT的转氨酶特性89-90
  • 2.4.3 PvTAT在迷迭香酸合成中的作用90-91
  • 2.4.4 小结91-92
  • 第3章 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的克隆与功能研究92-128
  • 3.1 试验材料93
  • 3.1.1 植物材料93
  • 3.1.2 载体与菌株93
  • 3.1.3 主要试剂93
  • 3.1.4 DNA的提取与相关感受态细胞的制备93
  • 3.1.5 主要仪器设备93
  • 3.2 试验方法93-106
  • 3.2.1 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的克隆与序列分析93-98
  • 3.2.2 对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的组织表达分析98
  • 3.2.3 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的诱导表达分析98
  • 3.2.4 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶PvHPPR的亚细胞定位分析98-101
  • 3.2.5 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶PvHPPR的原核表达及酶活检测101-103
  • 3.2.6 过表达夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的遗传转化103-106
  • 3.2.7 数据分析106
  • 3.3 结果与分析106-125
  • 3.3.1 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的克隆与序列分析106-113
  • 3.3.2 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR的表达分析113-114
  • 3.3.3 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶PvHPPR的亚细胞定位分析114-116
  • 3.3.4 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶PvHPPR的原核表达及酶活检测分析116-121
  • 3.3.5 夏枯草对羟基苯丙酮酸还原酶基因PvHPPR在毛状根中的过表达分析121-125
  • 3.4 结论与讨论125-128
  • 3.4.1 PvHPPR属于 2-羟基酸脱氢酶家族125
  • 3.4.2 体外酶活检测证明了PvHPPR的还原酶特性125-127
  • 3.4.3 PvHPPR在迷迭香酸合成中的作用127-128
  • 第4章 主要结论与展望128-132
  • 4.1 主要结论128-129
  • 4.2 展望129-132
  • 参考文献132-150
  • 作者简介150-152
  • 附录152-155

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