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《中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所)》 2018年
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新型荧光探针设计及其在缺氧胁迫下生物活性分子的成像分析研究

高敏  
【摘要】:随着环境污染日益加重,缺氧是其所带来的环境效应之一。环境效应关系到人和生物的生存及发展,因此应该高度重视对其作用机理的研究。细胞是环境影响生物体后首先作用的基本单元。环境缺氧会导致细胞内各种生物活性分子的改变,进而影响生物体的健康。环境成像分析技术是集合环境因素与光学分析方法于一体的综合分析技术,即将光学成像方法用于解决环境领域问题。它是一种无损成像分析技术,可通过荧光成像分析,检测生物体内源性物种的分布,探究环境因素是如何作用于生物体,以揭示环境异常与机体健康的关系。荧光探针是环境成像分析技术的一种重要研究工具。在本文中,我们专注于开发新型荧光探针用于环境缺氧胁迫下生物活性分子分析。首先从研究陆上典型实验哺乳动物出发,阐明环境缺氧对其机体内活性分子浓度、分布的影响,探究环境缺氧的作用规律,揭示机体内典型活性分子的环境指示意义,为进一步研究海洋水生生物提供科学依据和技术支撑。这些荧光探针具有出色的光学性能,响应靶标物后其荧光信号将发生变化,从而实现对靶标物的检测。本文的研究内容如下:(1)设计合成线粒体特异性近红外荧光探针Mito-SH,用于检测缺氧-缺糖细胞模型和急性缺血小鼠模型中的硫烷硫。探针Mito-SH由三部分构成:三苯基鏻阳离子和巯基苯甲酸分别修饰到氟硼荧荧光团的羟基上,亲脂性三苯基鏻阳离子可以将探针引导到细胞线粒体,巯基(-SH)响应单元可以选择性地响应硫烷硫以引发氟硼荧荧光团显著的近红外荧光发射变化。该探针在测试中对硫烷硫显示出高选择性,并且具有优异的光稳定性和较低的细胞毒性。探针Mito-SH已被应用于成像氧糖剥夺下细胞硫烷硫的动态变化。Mito-SH已成功用于急性缺血小鼠模型中的硫烷硫成像。急性缺血可导致海马活性氧的产生,硫烷硫通过直接消除活性氧而起到生理保护作用。因此,该探针可以作为研究细胞和活体中硫烷硫生理功能的潜在工具。该探针在细胞病理性缺氧中的成功应用为以后细胞在环境性缺氧中应用奠定了科研基础。(2)设计合成含硒近红外荧光探针BD-diSeH,用于检测环境缺氧胁迫下细胞内硫烷硫的水平变化。探针BD-diSeH由两部分组成:强亲核性的苯硒醇基团(-SeH)通过酯桥引入到氟硼荧荧光团中。BD-diSeH显示出优异的选择性和高灵敏度。探针BD-diSeH可用于检测环境胁迫下细胞内硫烷硫的水平变化。探针BDdiSeH还可用于成像三维多细胞球体中硫烷硫的分布。最后,探针成功地用于成像环境缺氧小鼠模型和斑马鱼中硫烷硫的变化。因此,该探针成功用于检测环境缺氧胁迫下细胞内硫烷硫浓度和分布,有利于阐明环境缺氧对机体的作用规律。(3)利用线粒体靶向近红外荧光探针Mito-SeH,检测缺氧胁迫下细胞及活体中硫烷硫的变化,阐明硫烷硫、活性氧和缺氧之间的关系。探针Mito-SeH可用于检测缺氧单层细胞和三维多细胞球体中硫烷硫浓度及分布,并揭示硫烷硫可以防止活细胞缺氧胁迫下的氧化损伤。硫烷硫通过清除线粒体中的活性氧来抑制半胱天冬酶依赖性凋亡。建立环境缺氧小鼠模型,利用探针Mito-SeH检测其体外解剖器官(心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏和大脑)中硫烷硫水平随缺氧时间的变化,并对各器官硫烷硫进行定量。建立小鼠急性缺血模型,利用探针Mito-SeH实时监测缺血过程中硫烷硫的变化,评价硫烷硫对缺氧胁迫下活性氧生成的抑制作用。探针Mito-SeH还可用于水体缺氧下斑马鱼中硫烷硫的检测。因此,探针MitoSeH为进一步探索硫烷硫在细胞和体内的生理和病理生物学作用提供了有价值的工具。探针在小鼠、斑马鱼中的成功应用为下一步研究海洋生物提供科研依据。(4)设计合成近红外荧光探针HCy-ONO,用于联动检测缺氧胁迫下超氧阴离子和多硫化氢的变化。探针由两部分组成:4-硝基苄醇被整合到花菁荧光团的中间位置;4-硝基苄醇作为多硫化氢响应基团,花菁既作为超氧阴离子的响应基团又作为荧光基团。HCy-ONO首先通过抽氢反应与超氧阴离子反应形成具有共轭体系的Cy-ONO,并释放低荧光。随后,Cy-ONO继续和多硫化氢反应将硝基还原为氨基,通过电子转移过程,释放花菁荧光团。探针反应灵敏,选择性和稳定性好,可用于在活细胞中成像超氧阴离子和多硫化氢。同时,构建连续缺氧条件和间歇缺氧条件,探针可实时监测活细胞内超氧阴离子和多硫化氢的动态变化。建立小鼠腹膜炎模型,探针通过检测超氧阴离子和多硫化氢即可辨别正常组织和发炎组织。探针还可用于捕获肿瘤组织中超氧阴离子和多硫化氢。因此,探针HCy-ONO为研究缺氧条件下氧化还原状态提供了新方法。(5)设计合成一种可激活的“发夹”型荧光探针YLS,用于在活细胞和体内基于迈克尔型反应标记硫氧还蛋白还原酶,从而进行肿瘤成像。探针由三部分构成:硫氧还蛋白还原酶的抑制剂2a作为响应基团,6-(苯并[d]噻唑-2'-基)-2-(甲基氨基)萘作为荧光团,直链烷基链作为连接体。通过硫氧还蛋白还原酶还原后,折叠构型的探针YLS被拉伸形成展开构型的探针YLS,然后荧光开启。探针YLS可用于检测不同细胞系中的硫氧还蛋白还原酶活性。探针YLS能有效地抑制硫氧还蛋白还原酶活性和提高活性氧水平,并最终诱导细胞凋亡。此外,探针已成功地用于人肺癌细胞裸小鼠移植瘤中成像硫氧还蛋白还原酶,从而对肿瘤进行成像。因此,该探针在研究硫氧还蛋白还原酶的生理和病理功能、细胞氧化还原信号转导过程和开发癌症诊断和治疗的诊断剂方面有着巨大的应用前景。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所)
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:O657.3

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