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《中国农业科学院》 2011年
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莱姆病两种检测方法的建立

付钰广  
【摘要】:莱姆病是一种自然疫源性人兽共患病,由伯氏疏螺旋体引起,通过传介蜱叮咬人或动物传播。该病临床表现复杂多样,可引起人体多系统、多器官的损害,严重者终生致残甚至死亡,除威胁人类健康外,还通过危害家畜健康对畜牧业的发展构成了威胁,已成为全球公共卫生问题,于1992年被世界卫生组织列入重点防治研究对象。 对莱姆病的研究,大多研究集中在人上,在动物上的研究相对较少。由于蜱是伯氏疏螺旋体的传播媒介,动物是其贮存宿主,它们在莱姆病的传播中发挥着重要的作用。本研究建立了伯氏疏螺旋体血清学诊断方法ELISA和病原学检测方法real-time PCR,并运用这些方法对我国部分疫区进行了流行病学的初步调查。 以伯氏疏螺旋体SZ(B. garinii)、BO23(B. afzelii)和B31(B. burgdorferi sensus stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,通过PCR扩增出目的片段,克隆到表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒,表达的蛋白用MagneGSTTM Protein Purification System纯化。纯化的蛋白用三株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western Blot(WB)检测,结果显示这三个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应,表明该重组蛋白是建立检测羊体内伯氏疏螺旋体相应抗体ELISA方法的理想抗原。 本研究中,SZ菌株的OspC重组蛋白用来建立了ELISA。建立的ELISA方法通过检测200份阳性血清和214份阴性血清,估算出了该方法的敏感性和特异性分别为87.5%和86.4%。该方法与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、巴贝斯虫(临潭、宁夏、新疆、河北、天竺)、羊无浆体和羊弓形虫的羊的阳性血清没有交叉反应。通过调查502份(2004年)和360份(2010年)采集自甘肃省甘南自治区的羊血样品,检测阳性率分别为5.4%和9.4%。 通过参考Genbank中发表的伯氏疏螺旋体16S rRNA基因序列,设计检测伯氏疏螺旋体的通用引物和探针,建立了real-time PCR。该方法可特异性的检测出阿氏疏螺旋体(B. afzelii)、伽氏疏螺旋体(B. garinii)和狭义伯氏疏螺旋体(B. burgdorferi sensu stricto),而与泰勒虫、巴贝斯虫、无浆体、衣原体和支原体病原无交叉反应。其敏感性为常规PCR的104倍,能从22.88 fg的基因组DNA中检测到伯氏疏螺旋体核酸。通过检测采集自黑龙江尚志市的369份蜱(革蜱属)样品,及采集自甘肃省甘南自治州的186份牦牛和146份绵羊样品,阳性率分别为42.8%、24.19%和39.04%。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R514;S855.99

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【参考文献】
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