半矮生型桃新梢生长跃变期差异表达基因的cDNA-AFLP分析

【摘要】：桃是我国第三大落叶果树,栽培面积和产量均居世界首位。但是桃过大的营养生长量不仅增加了管理难度、修剪用工和生产成本,而且造成树体营养的大量浪费,这是桃产业发展中迫切需要解决的关键问题之一。然而,目前生产上适合果树简易化管理的优良品种较为匮乏。半矮生型桃“SD9238”是在中国农业科学院郑州果树研究所育种圃实生苗后代中发现的突变体,该突变体树体仅为普通型的1/2-2/3,节间较短,果枝粗壮而长度适中,年修剪量极小,是调控桃树树势、实现树体有限矮化的理想基因资源。其早期生长缓慢,5月中旬之后进入迅速生长期,与普通型截然不同。 本研究以“SD9238”为研究试材,利用cDNA-AFLP差显技术分析其新梢生长跃变期前后4个生长阶段差异表达基因,获得不同生长阶段基因表达的差异片段,对这些片段进行分析、克隆和序列测定,并对这些基因序列进行生物信息学分析和功能鉴定,然后通过荧光实时定量RT-PCR技术对试验结果进行验证,为进一步揭示半矮生桃生长调控的分子机理奠定基础。主要研究结果如下: (1)建立并优化了半矮生桃新梢的RNA提取技术体系和cDNA-AFLP技术体系。 (2)对半矮生桃新梢生长跃变期4个不同生长阶段的基因表达差异进行了cDNA-AFLP分析,获得了与生长调节相关的特异基因片段,并对这些基因的功能进行了研究。利用256对引物组合进行了选择性扩增,共得到差异条带1987条,通过回收、克隆获得了其中497条目的片段,并对其进行了序列测定。通过BlastX同源性分析与Blast2go软件相结合,对目的基因进行了更准确的功能鉴定。 BlastX同源性检索分析表明,254条具有高度同源蛋白。其中,功能未知的基因51条,其它目的基因的同源蛋白有肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、F-box蛋白家族、类Tubby蛋白(TLP)、生长素水解酶、细胞色素P450、油菜素内酯受体、及细胞分裂素氧化酶等与生长调节相关的蛋白以及各类转录因子、代谢途径关键酶、热激蛋白等。另外,有80条差异表达基因在GenBank数据库中未找到相似序列。 Blast2go软件的分析结果表明:132个没有相似序列的目的片段,可能是新基因;其余365个有同源蛋白的目的基因可按功能分为50类。目的基因可能参与的反应主要有乙醛酸代谢、淀粉代谢及蔗糖代谢等代谢途径;生长素、叶绿醌及泛醌等的生物合成过程;对光刺激、温度刺激及氧化等的应激反应;细胞定位;光合作用;跨膜运输及转录调控等。 (3)从利用cDNA-AFLP技术分离得到的差异片段中选择性挑选25个进行荧光实时定量RT-PCR试验,目的基因表达量以参照基因(RPⅡ)作为标准进行相对定量分析。结果与cDNA-AFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳的显示较为一致。