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《中国农业科学院》 2011年
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CPV VP2截短基因的克隆表达及双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

王净  
【摘要】:犬细小病毒(Canine Parvovirus, CPV)属细小病毒科,细小病毒属成员。细小病毒是已发现的病毒中个体最小、结构最简单的DNA病毒。VP2是组成CPV衣壳的主要结构蛋白,全长VP2蛋白表达时不能溶解,主要以包涵体的形式存在。为了提高外源基因表达量,对重组蛋白的可溶性研究非常必要。犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的一种犬烈性传染病,主要危害2-6月龄幼犬。此病感染率可达到100%,死亡率达到10%-50%,此病对养犬业造成很大危害,因此建立低成本、高检出率、特异性强、简便、快速的CPV检测方法成为该领域的研究热点。 本研究利用生物信息学手段,分析分离CPV-2a株VP2基因疏水性、抗原性等指标,设计两对特异性上下游引物,PCR扩增出目的基因,连接pEASY-T1载体,重组质粒经BamHI和XhoⅠ双酶切,连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a-306和pET-32a-363。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达目的蛋白并纯化,SDS-PAGE电泳分析并经Western blotting和间接ELISA试验鉴定。结果表明:成功构建了克隆载体pEASY-306、pEASY-363和表达载体pET-32a-306和pET-32a-363,高效表达了目的蛋白,融合蛋白分子量大小为30kDa和33kDa,且都为可溶性蛋白。镍琼脂糖凝胶FF柱纯化目的蛋白,纯化蛋白Western blotting鉴定,证明蛋白融合表达并且具有反应原性,间接ELISA试验证明纯化蛋白具有抗原性和特异性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。 用PEG20000纯化犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV),免疫新西兰大白兔,制备抗CPV多克隆抗体,培养单抗细胞,注射小鼠制备单克隆抗体。AKTApurifier层析仪纯化两种抗体,SDS-PAGE电泳分析显示,得到较纯抗体,出现50kDa和25kDa分子量大小的两条带。基于纯化的两种抗体,建立双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化ELISA条件,确定兔阳性血清作为捕获抗体,以0.05M碳酸盐1:800稀释,单克隆抗体作为检测抗体1:2000稀释;包被条件为37℃1h加4℃12h;抗原作用时间为37℃反应90min;10%牛血清37℃2h为最佳封闭条件;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体反应最佳条件为1:4000倍稀释,37℃作用30min;最佳显色时间为37℃5min。所建立的ELISA方法可用于CPV的检测,用建立的方法检测北京昌平80份犬样本,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。双抗体夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S855.3

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