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《中国农业科学院》 2011年
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棉花杜松烯合成酶基因的克隆及其表达分析

周婷  
【摘要】:我国转基因抗虫棉主要的外源抗虫基因——Bt基因对鳞翅目害虫如棉铃虫、红铃虫有着良好的抗性。但是随着转基因抗虫棉的大面积推广和多年的田间应用,科学家们发现由于杀虫剂用量下降,近些年来导致蚜虫、绿盲椿象、棉粉虱等非主要害虫的为害加重。另外,棉花黄萎病是棉花生产中最重要的病害,严重影响棉花的产量。黄萎病致病机理复杂,研究进展缓慢,育种效率较低,目前尚缺乏高抗品种。在棉花色素腺体中有棉酚等次生代谢物的沉积,它们对棉田中的多种害虫以及棉花病害均有良好的抗性。因此通过基因工程对棉酚的次生代谢过程进行有效地调控来提高棉酚的含量,具有重要的理论和应用价值。 杜松烯合成酶催化法呢基焦磷酸(FPP)环化形成(+)-δ-杜松烯,这是棉酚合成途径中的限速反应。(+)-δ-杜松烯是所有棉酚及其衍生物的共同前体物质。本实验从陆地棉Y18R中克隆了杜松烯合成酶基因(Cdn)并分析了其cDNA和基因组序列。Cdn基因的基因组序列为2700bp,具有6个内含子,剪切后其转录本为1665bp,编码554个氨基酸残基。该基因编码的蛋白质具有萜类合成酶(环化酶)的保守活性区域——DDXXD。蛋白进化树分析表明,此基因属于杜松烯合成酶C亚家族成员。应用Overlap PCR方法将Cdn基因上的2个HindⅢ酶切位点钝化,但不改变其编码的氨基酸序列。 将Cdn基因连接到表达载体pBI121上,由组成型启动子CaMV35S和绿色组织特异性启动子Psbp分别驱动其表达,成功构建了2个植物表达载体pGBI-CaMV35S-Cdn和pGBI-Psbp-Cdn。另外还应用Gateway法构建了一个RNAi干扰载体pK7GWIWG2(I),0-571。构建好的3个载体通过农杆菌介导法转化棉花下胚轴并进行组织培养,分别获得了9个35S转基因(pGBI-CaMV35S-Cdn)愈伤系和小苗、2个P转基因(pGBI-Psbp-Cdn)愈伤系和小苗、4个R转基因(pK7GWIWG2(I), 0-571)愈伤系。 Real-Time PCR分析发现愈伤系中35S-1至35S-7的Cdn基因mRNA表达量是非转基因对照的8.97-9.64倍;35S-8和35S-9表达量分别是非转基因对照的2.88和3.34倍。P-1和P-2中Cdn基因mRNA表达量分别是对照的1.33和1.28倍。说明通过表达载体的转化,Cdn基因转录水平的表达量均有所增加。R-1至R-4的Cdn基因的mRNA表达量分别是对照的0.43、0.49、0.55和0.41倍。说明经过RNAi干扰,Cdn基因转录水平的表达量明显被抑制。 对各愈伤组织系进行棉酚含量的测定,35S-1至35S-7愈伤组织中的棉酚含量分别为非转基因对照的161%-186%;35S-8和35S-9愈伤组织中的棉酚含量分别为非转基因对照的141%-149%。P1和P2愈伤组织中棉酚含量分别为非转基因对照的132%和118%。R系愈伤组织中棉酚含量分别为非转基因对照的96%、108%、109%和92%。由此可以看出,在愈伤组织中,35S系和P系转基因愈伤中的棉酚含量均高于非转基因对照,而R系的棉酚含量与对照十分接近,没有如预期中的明显降低。结合前面的愈伤系中Cdn基因mRNA表达量的结果,发现Cdn基因mRNA表达量与棉酚含量的提高有着一定的正相关性,Cdn基因表达量越高,棉酚含量也会相应提高。但是R系中Cdn基因mRNA表达量较对照降低了50%左右,但是其棉酚含量却与对照基本一致,没有随着其Cdn基因mRNA表达量的下降而显著降低,推测可能是由于Cdn基因亚家族的冗余互补造成的。 棉酚的形成是一个累积的过程,苗期的棉酚含量普遍高于愈伤组织阶段。在苗期,35S系中35S-1至35S-7的棉酚含量高于对照17%-38%,35S-8和35S-9系的棉酚含量高于对照16%和7%;P系中P1和P2的棉酚含量分别高于对照12%和17%。愈伤组织诱导成苗后,小苗35S系和P系中的棉酚含量虽然仍高于对照,但差距在减小。尽管P系中的棉酚含量与对照的差距也在缩小,但下降幅度比35S系要低。初步判断,在苗期绿色组织特异性启动子Psbp的启动效率逐渐提高。 褐化的愈伤组织中棉酚含量比对应的正常愈伤组织中的要略高一些,但无显著提高。比较35S系、P系、R系及非转基因对照的出愈率,发现三种转基因系的出愈率彼此之间并无很大的差别,均在85%-90%之间,而非转基因对照的出愈率为97%,说明农杆菌侵染这一过程可能会降低棉花组培时的出愈率。而此时棉酚含量对棉花组培时出愈率的影响并不大。在愈伤组织逐渐成苗的阶段,会出现一些玻璃苗,检测发现对照玻璃苗中的棉酚含量略高于正常苗5%,棉酚含量对玻璃苗的形成是否有消极影响尚待进一步实验证实。转基因愈伤35S系和P系的正常出苗率均很低,约在10%左右,远低于非转基因对照的53%。我们推测,棉酚含量提高虽然对出愈率影响不大,但随着棉酚在组培过程中的积累,最终还是抑制了愈伤组织的出苗率。 综上所述,本研究内容为培育植株高酚、种子低酚的棉花理想品种提供了理论基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S562

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