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棕色棉色素相关基因RNA干扰载体构建及表达分析

冀荣  
【摘要】:本研究以RT-白絮(白)、棕絮1号(棕)及棕1-61(深棕)为试验材料,利用化学显色法及紫外分光光度法对3种材料不同发育时期纤维色素物质及相对含量变化趋势进行了研究;利用基因工程方法构建CHS及F3’5’H基因的ihpRNA及amiRNA干扰载体并通过花粉管通道法转化棕色棉以进行基因功能验证;以RT-白絮、棕1-61为试验材料,通过实时荧光定量PCR结果分析类黄酮合成途径转录因子基因CPC、TT8及TTG1基因在不同纤维发育时期的表达量差异,试图从分子水平解释彩色棉纤维品质及色素物质形成的关系。本研究主要结论如下: 1.通过RT-白絮、棕絮1号及棕1-61不同发育阶段纤维及叶、花、蕾甲醇提取液的NaOH、盐酸-镁粉显色反应和紫外光谱扫描,综合分析以上结果得出结论认为RT-白絮、棕絮1号及棕1-61不同发育阶段未成熟纤维中均含有黄酮醇或二氢黄酮醇,成熟纤维中则不含有;纤维发育各阶段相关色素物质含量比较结果:棕1-61棕絮1号RT-白絮,其中+28DPA后白色棉与棕色棉色素相关物质含量基本一致,棕1-61+60DPA棉纤维色素相关物质含量高于棕絮1号及RT-白絮;白色棉各时期色素相关物质含量差异较小,棕色棉各时期色素相关物质含量变化趋势一致,均在+17DPA达到最大,棕絮1号在+60DPA最低,棕1-61在+28DPA达到最低。 2.利用NCBI公布序列信息,设计特异引物,获得了查尔酮合成酶基因CHS及类黄酮3’5’羟基化酶基因F3’5’H的mRNA序列全长;利用pHANNIBAL载体及棉花纤维发育特异启动子SCFP,构建了由组成型启动子CaMV35S及SCFP共同启动的分别靶向CHS及F3’5’H基因的ihpRNA干扰载体,并通过花粉管通道法进行了遗传转化试验。 3.以棉花microRNA序列Ghr-MIR156d作为骨架,利用micrRNA设计平台WMD-3(http://wmd3.weigelworld.org)设计了靶向CHS及F3’5’H基因的amiRNA前体序列,并通过与植物表达载体重组连接,构建了靶向CHS及F3’5’H基因的amiRNA干扰载体,并通过花粉管通道法进行了遗传转化试验。 4.通过实时定量荧光PCR分析了3个不同看家基因Hitone、Actin及Gbpolyubiquitin在RT-白絮和棕1-61+13、+17、+23、+28DPA纤维样品中的相对表达量的差异,获得了适用于在+13DNA至+18DPA纤维基因表达分析的稳定内参基因Gbpolyubiquitin基因; 5.通过实时定量荧光PCR分析了3个类黄酮合成途径转录因子基因CPC、TT8及TTG1在RT-白絮和棕1-61+13、+17、+23及+28DPA纤维样品中的相对表达量差异,CPC及TTG1基因在白色棉纤维发育各个时期表达量均高于棕色棉,TT8基因在棕色棉纤维发育各个时期表达量均高于白色棉,结合RT-白絮及棕1-61纤维品质特征,得出结论认为:CPC、TT8及TTG1可能形成类似MYB-bHLH-WD40复合体共同调控天然棕色棉纤维发育,CPC及TTG1可能参与棉纤维发育的产量性状形成的调控途径,而TT8可能参与调控棕色棉色素物质合成途径。


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