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《中国农业科学院》 2011年
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拟除虫菊酯类农药降解基因estA的表达、纯化及活性分析

许玮  
【摘要】:近年来,随着拟除虫菊酯类农药的广泛使用,由菊酯类农药残留产生的环境、食品污染和农产品国际贸易问题越来越严重,菊酯类农药的生物降解逐渐成为研究的热点。本论文以课题组已克隆的拟除虫菊酯类农药降解基因estA (genbank:DQ906143)为出发基因,进行了基因产物二级、高级结构的生物信息学分析;全长基因序列和具反应活性结构域基因序列的原核表达;表达产物的电泳检测、复性及复性条件;表达产物的反应条件、环境稳定性及对农药的降解等方面的研究,为进一步利用降解酶基因资源研制拟除虫菊酯类农药降解酶制剂,解决农产品农药残留提供技术平台。 EstA的生物信息学研究表明:EstA的分子量和等电点的理论值分别约为64.6KDa和4.40;EstA的二级结构为23.50%的α螺旋、25.12%的p折叠、7.13%的p转角和44.25%的无规卷曲。α螺旋存在明显的结构域差异性,其中80.6%的α螺旋存在于在第一个结构域(1-370aa)中;EstA无二硫键和信号肽;EstA具有两个结构域,第一个结构域包含前370个氨基酸,与酶催化活性相关,第二结构域包括剩余247个氨基酸(371-617);EstA的催化位点为Ser207,ASP255和His313;EstA中存在钙结合位点,分别为LyS278、Asp283、ASp337、Ala281。 EstA全长编码基因和催化活性结构域编码基因的原核表达研究表明:全长编码基因的表达产物具酯酶活性,而单一催化活性结构域编码基因的表达产物无酯酶活性,证明EstA的第二个结构域虽然不具有催化位点,但可能与酶活性构象的形成密切相关;原核表达的EstA主要以包涵体形式存在,包涵体可经6mol/L的尿素有效溶解;EstA分解α醋酸萘酚实验证明该酶具有羧酸酯酶活性,以羧酸酯酶活性为检测指标的实验表明:EstA表达产物的最佳复性条件为:pH7.5、Ca2+浓度2mmol/L、蛋白浓度20μg/mL。 对EstA活性表达产物的理化性质研究表明:该酶的最适反应条件(α醋酸萘酚为底物)为:pH 7.0、Ca2+浓度0.1mmol/L、温度35℃。气相色谱检测活性EstA对部分农药的降解结果表明:该蛋白对拟除虫菊酯类农药高效氯氰菊酯、氯菊酯、氯烯炔菊酯、功夫菊酯及有机磷类农药毒死蜱有降解能力,30℃条件下温育八小时对上述农药的降解率分别为:高效氯氰菊酯:79.07%、功夫菊酯:24.29%、氯烯炔菊酯:19.73%、氯菊酯:44.74%、毒死蜱:27.42%。 极端环境实验表明:EstA表达产物具高温、强酸、强碱的耐受性,70℃温育2h,酶活性仅下降12%;pHl.08h酶活下降78%;pH148h酶活下降22%。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78;S481.8

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【引证文献】
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【同被引文献】
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