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《中国农业科学院》 2011年
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阿维菌素4"-OH氧化酶CYP107Z13的基因克隆、表达及功能验证

刘卫德  
【摘要】:阿维菌素是一种结构新颖、农畜两用的重要生物源杀虫剂,对阿维菌素4"-OH进行改造可以获得药效更高、杀虫谱更广的甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)。当前,甲维盐的生产是以天然发酵产物阿维菌素为前体,通过化学方法合成,其中最关键的反应步骤是将阿维菌素4"-OH氧化为4"-O。由于在对阿维菌素4"-OH氧化前后必须对分子中更加活跃的5-OH进行保护和去保护,且这个保护-去保护过程操作复杂、条件要求苛刻,导致了甲维盐合成成本较高且对环境污染严重。寻求廉价、高效、环保的生物催化剂,实现对阿维菌素4"-OH的位点特异性氧化,将大大简化甲维盐的合成步骤,有利于甲维盐的推广应用。据报道,一些链霉菌具有位点特异性氧化阿维菌素生成4"-O-阿维菌素的功能。笔者针对链霉菌进行筛选,获得一株能够高效氧化阿维菌素4"-OH生成4"-O的不吸水链霉菌菌株ZB01 (Streptomyces ahygroscopicus ZB01, CGMCC NO.2804),该菌株在72 h内对初始浓度为1 g/L的阿维菌素转化率达36%,是已报道的转化效率最高菌株的两倍多,具有较大的开发应用潜力。本研究以S. ahygroscopicus ZB01为出发菌株,展开了一系列的研究。结果如下: 1.利用同源克隆及染色体步移的方法,从S. ahygroscopicus ZB01菌株基因组中克隆到一条cyp107z亚家族基因的同源基因,其全长1290 bp,共编码429个氨基酸残基,经国际P450命名委员会命名为cyp107z13,是cyp107z基因亚家族的第13个新成员。 2.利用多拷贝型大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139,建立了组成型启动子ermE*P调控下的cyp107z13链霉菌表达载体,采用原生质体转化法将重组质粒转入变铅青链霉菌TK54 (Streptomyces lividians TK54)中,经CO光谱分析和HPLC检测,证实cyp107z13基因在S. lividians TK54中成功表达,并且表达的CYP107Z13能利用S. lividans TK54的电子传递系统实现电子传递,完成位点特异性氧化阿维菌素4"-OH生成4"-O-阿维菌素的反应。 3.对上述S. lividians TK54重组菌的转化条件进行优化,结果显示,培养基种类、pH值和菌体的活力状态对重组菌转化阿维菌素的效率有不同程度的影响。其中pH 6.0、改良ISP-2液体培养基以及活化细胞有利于提高重组菌转化阿维菌素的效率。 4.利用pET28a载体,构建cyp107z13的重组质粒pET-z13,将pET-z13转入Escherichia coli BL21(DE3)中,经ELISA及CO差光谱法检测,证实CYP107Z13已在E. coli BL21(DE3)中成功表达,并采用Ni-柱亲和层析法纯化了带His_6标签的活性CYP107Z13重组蛋白。 5.利用纯化的CYP107Z13重组蛋白,与铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶构建体外重组酶催化体系,通过测定体系中NADPH的消耗,获得了该重组蛋白以阿维菌素为底物时的酶学参数,其K_m值为1.4μM,V_(max)为0.041μmol/min·mg,kcat为0.033 s~(-1)。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S482.3

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