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副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失株的构建及胞外丝氨酸蛋白酶免疫原性的研究

张念章  
【摘要】:副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的常在菌。其致病菌在一定条件下可引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的革拉泽氏病(Glasser’s Disease)。近年来,该病在保育猪群中的发生逐年上升,已成为危害养猪业的重要传染病之一,受到人们的日益重视。虽然近几年加大了该病原的研究力度,筛选出大量的毒力相关基因,但目前为止尚不十分清楚HPS的致病机理。 本研究利用重叠PCR(overlapping PCR)的方法构建了HPS hhdA基因的外源打靶基因Hup-Kan-Hdown。将其连接至自杀性质粒载体pDS132,获得了可在宿主菌E.coli SM10λpir中稳定遗传的外源打靶载体pDS-HPhhdA-Kan。将该打靶载体用电转法导入HPS中,经卡那霉素抗性筛选和蔗糖负筛选,得到HPS hhdA基因缺失株(HPS hhdA)。生化试验表明,该突变株的生化特性及NAD生长依赖性未见改变。生长曲线的测定表明该突变株的生长慢于标准株。豚鼠感染试验表明毒力变化不明显。说明hhdA基因不影响HPS的生长、繁殖,与其致病力无明显相关性。本试验建立的HPS遗传操作突变系统为实验室日后验证HPS各种基因功能奠定基础。 本研究对HPS的一种胞外丝氨酸蛋白酶(extracellular serine protease, esp)进行了序列分析并将该蛋白进行原核表达。HPS esp一级结构分析表明,前23个氨基可能为信号肽序列。C端转运单位氨基酸序列的系统进化树表明,该蛋白与流感嗜血杆菌中IgA蛋白酶的亲缘关系较近。承载结构域抗原表位的分析表明,50~57、95~108、120~130、185~196、230~241和421~425等6个氨基酸序列表位抗原的可能性较大。将克隆的esp基因连接至表达载体pET30a,构建了表达质粒pET-esp。将测序鉴定正确的重组表达质粒利用IPTG进行诱导表达。经大量诱导条件优化试验,得到了IPTG终浓度为0.6 mmol/L,32℃振荡培养6 h的最优表达条件。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量约为82 kDa。以该蛋白为抗原,加入等体积的206佐剂免疫豚鼠,3次免疫后以浓度为5×10~9 CFU/mL的菌液进行攻击试验,每只豚鼠注射1 mL。结果表明,esp可以部分保护HPS的感染(6/12),有望成为HPS病免疫诊断和疫苗研制的候选抗原。


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