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《中国农业科学院》 2011年
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海岛棉ERF族B3和B1亚组转录因子基因的克隆与特征研究

刘坤  
【摘要】:棉花是重要的经济作物,各种病害特别是黄萎病严重影响着棉花生产,基因工程技术的发展为棉花抗病育种提供了新途径。ERF族转录因子通过ERF域和GCC-box等顺式元件相互作用,调控下游基因如病程相关蛋白基因的转录过程,从而改变植物抗病、抗逆性状,在植物抵抗生物和非生物胁迫中扮演重要角色。ERF族转录因子分为不同组类,其中B3亚组成员通过上调启动子中含有GCC-box元件基因的转录活性,增强植物体抗病性,而B1亚组转录因子对启动子中含有GCC-box基因的转录活性起抑制作用,具有防止下游基因过度激活的功能。克隆这两亚组基因、探究其生物学功能,对农作物抗病性状的遗传改良具有重要意义。 为了克隆与棉花黄萎病抗性相关的B3/B1亚组转录因子基因,本研究首先利用陆地棉EST库进行电子克隆,获得20个B3亚组和9个B1亚组陆地棉ERF族基因。然后根据海岛棉和陆地棉的同源性及ERF族转录因子的保守性,以黄萎病处理的海岛棉幼苗cDNA为模板,利用PCR技术扩增出29个具有完整阅读框的同源基因,其中27个是第一次从海岛棉分离出的新基因。利用实时荧光定量技术,对大丽轮枝菌孢子液处理的海岛棉幼苗根组织中各基因转录本量分析发现:GbB3002、GbB3003、GbB3009、GbB3016-20、GbB1006、GbB1007等多个基因明显增加,上调幅度在7倍以上;GbB3012和GbB3015两个基因只有处理前的三分之一左右;GbB3010基本没有变化;其它基因虽有上升,但上调幅度较小,都在5倍以下。利用RACE技术扩增基因的5’-和3’-UTR,获得4个基因全长cDNA序列,分别命名为GbEREB3(GbB1007)、GbEREB4 (GbB1006)、GbEREB5 (GbB3009)和GbEREB6 (GbB3015),并提交到NCBI GenBank数据库,注册号分别是JN003806,JN003807,JN003808,JN003809。 在利用生物信息学对4个基因分析的基础上,构建GFP瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果表明四个转录因子均分布于核内;利用BL21(DE3)原核表达菌株,表达GST和转录因子融合蛋白,纯化后进行凝胶阻滞实验,证明它们和GCC-box能够特异结合;构建超表达载体转化烟草,对T_0代植株进行半定量和荧光定量分析发现, GbEREB3/4和GbEREB5/6在转基因阳性植株中均得到异位表达,而防卫基因NtCHI-B和NtPR2的转录本量相应地减少和增加,该结果表明GbEREB3/4和GbEREB5/6分别具有下调和上调NtCHI-B和NtPR2基因转录活性的功能,暗示这些基因参与防卫反应过程。另外,构建超表达载体将B1亚组(Gb)EREB2(GbB1004)基因转入陆地棉,实时荧光定量分析表明T_0阳性棉株中几丁质酶(CHI)和β-1,3-葡聚糖苷酶(BGL)基因的转录活性下降;测量GbEREB2转基因阳性棉株的离体叶片失水率发现比受体叶片更容易失水,表明GbEREB2基因不仅参与棉花的防卫反应过程,而且与植物的水分代谢生理过程密切相关。 研究表明这些基因参与棉花对黄萎病菌防卫反应的应答过程,可能参与棉花对黄萎病抗性的调控。有关转基因阳性株系对黄萎病菌抗性水平的鉴定分析研究,正在进行之中。本研究为抗黄萎病相关基因的筛选奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S562

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【共引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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