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《中国农业科学院》 2011年
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猪源TTV:分子流行病学,全长序列分析及感染性分子克隆的构建

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【摘要】:输血传播病毒(Torque teno virus, TTV)是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的DNA病毒,目前该病毒被归于圆环病毒科的指环病毒属。TTV是继甲、乙、丙、戊型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎病毒。该病毒最早是由日本学者于1997年从一例输血后发生急性感染的非甲~戊型肝炎病人血清中发现的,因而被称输血传播病毒。调查发现TTV在人群中感染率很高,在猪、牛、羊、猫、狗等多种动物体内也相继发现有TTV的感染。 猪源TTV在全世界大部分猪场都具有很高的感染率,引起了人们的广泛关注。目前的流行病学调查显示,猪源TTV和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒共感染可诱发猪的皮肤肾炎综合症,和猪圆环病毒共感染可诱发断奶仔猪代谢综合症,还可能与猪圆环病毒或猪戊型肝炎病毒共同诱发猪的传染性肝炎。由于猪源TTV具有潜在的危害,目前对此病毒的了解非常少,因此对其进行相关的研究是非常必要的。 本文根据GenBank上发表的PCV2基因组序列和TTV1和TTV2的非编码区(UTR)序列设计合成引物,分别建立了用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。对来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品进行了检测,结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%,二者的混合感染率为34.5%。94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染,占样品总数的36.4%;193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染,占74.8%;另外,还有一些样品为三重感染,占34.5%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分UTR片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2的UTR序列进行比较分析。分析结果显示本研究获得的TTV1毒株之间的UTR核苷酸同源性为80.8%-98.5%,TTV2毒株之间的UTR核苷酸同源性为94.2%-100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%-100%和95.5%-99.1%。本研究从基因水平证实我国猪群中存在TTV的感染,提示我们TTV对猪群是一个不容忽视的新病原,并且确定了猪群中PCV2与TTV1和/或TTV2混合感染情况。 从流行病学调查为阳性样品中选取其中病毒滴度高的样品,进行全长序列的扩增,测序过程中发现,在TTV1和TTV2基因组中均存在一段高GC并且有特殊结构的区域,导致测序结果不理想。针对这一问题,分别设计了2对和3对覆盖TTV1和TTV2全长的套式PCR引物,对阳性样品进行扩增,获得了7株全长序列,3株TTV1,4株TTV2。将所得到的TTV序列与GenBank中的10株参考序列进行核苷酸和氨基酸的比对和分析,核苷酸比对结果显示,获得的猪源TTV1和TTV2之间的同源性不到10%,TTV1分离株之间的核苷酸同源性为94.6-96.5%,与参考序列的同源性为61.5-98.3%,TTV2分离株之间的核苷酸同源性为92.4-94.8%,与参考序列之间的同源性为85.4-96.2%。氨基酸比对结果显示,TTV1分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均97.5%以上,但与参考序列的同源性则分成了两种情况,与AB076001和GU456383参考序列的同源性在97.5%以上,而与其他4株参考序列的同源性则不到50%。TTV2分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均在88.3%以上,而和参考序列的同源性均在80%以上,只与参考序列GU88046 ORF3的同源性出现了低于50%的例外。通过比较分析也发现,TTV三个ORF的氨基酸同源性普遍低于核苷酸的同源性。与此同时,还发现核苷酸同源性大于90%的TTV序列之间,存在高频率的G/A碱基互换,在TTV1的ORF1中,其互换率在40-57.6%之间,ORF2的互换率在50-60%之间,明显高于其他碱基之间的互换率,而在TTV2中核苷酸同源性大于90%的序列只有两株,其ORF1的G/A的互换率为27.7%和42.9%,高于其它碱基的互换,在ORF2中,互换率为60%,明显高于其他碱基的互换率。进一步的研究表明去甲基化能明显减小测序困难,其中对FJ/China/2010/TTV2/2的测序完全正常,对FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列进行了GC岛、DNA二级结构的预测和甲基化水平分析,结果表明,在FJ/China/2010/TTV2/2的难测区和高GC区均存在复杂的茎环结构,但没有GC对的甲基化。 对猪源TTV2中的假想蛋白ORF1,ORF2进行原核表达,由于ORF1 N端含有大量疏水氨基酸,因此对ORF1进行了截短,即ORF1a,表达结果显示ORF1a为包涵体,ORF2为可溶性蛋白。通过包涵体纯化和谷胱甘肽亲和层析(GST)纯化获得高纯度的可溶性重组蛋白,将纯化的ORF1a蛋白和ORF2蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,ELISA效价可达1:6000。另外,分别将TTV2的ORF1,ORF2和ORF3克隆到真核表达载体3×Flag中,构建了重组的真核表达质粒3×FLAG-ORF1,ORF2和ORF3。将其转染细胞,通过自制抗体的间接免疫荧光(IFA)试验证明了自制抗体的有效性,且通过3×FLAG标签抗体的IFA对三个假想蛋白进行了细胞定位,结果显示ORF1蛋白是核定位的,ORF2蛋白分布在整个细胞,ORF3蛋白主要集中在核浆中,在核仁的外围尤为明显。 由于猪源TTV在猪体内的含量比较低,目前还没有能够支持其复制的细胞系,所以其分子机制和生物学的研究一直受到限制。为了研究猪源TTV的一些关键的分子生物学活性(如转录和复制),本研究分段扩增了FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列,该序列全长2796个核苷酸,与最早分离出的TTV2原型Sd-TTV2p (AY823991)的同源性为85.4%,用该序列构建出了分别含有1.0个,1.3个,2.0个全长基因组的载体为pSK的质粒。通过将构建质粒转染PK15细胞,48h后的Northern Blot实验,验证了三个主要阅读框的存在和ORF3剪切的发生;通过基于酶切的Southern Blot实验进行了病毒复制的研究,没有检测到构建质粒在PK15细胞中的复制;用自制ORF1a,ORF2抗体,通过间接免疫荧光实验检测构建质粒的蛋白表达情况,在72h后能够用ORF1a抗体检测到ORF1的蛋白表达,但ORF2抗体没有检测到荧光。Northern Blot和IFA试验证明了我们所构建的猪源TTV感染性分子克隆的可行性。这些实验为研究TTV的分子生物学机制搭建了平台,也为找到可以培养TTV的细胞系奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 蒋林彬;施建飞;刘妍;刘文;思兰兰;钟彦伟;徐东平;;1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达[J];解放军医学杂志;2010年06期
2 庄辉;TT病毒的研究现状及展望[J];中华内科杂志;1999年11期
3 肖红,骆抗先,杨守昌,王燕军,梁蔚芳;TT病毒在恒河猴实验感染的组织嗜性(英文)[J];Chinese Medical Journal;2002年07期
4 M Irshad;YK Joshi;Y Sharma;I Dhar;;Transfusion transmitted virus: A review on its molecular characteristics and role in medicine[J];World Journal of Gastroenterology;2006年32期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨克礼;徐涤平;梁望旺;刘泽文;汪宏才;;鸡传染性贫血病研究进展[J];家禽科学;2007年04期
2 宋月;姜艳萍;崔文;李一经;;猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定[J];东北农业大学学报;2012年03期
3 王涛,王子轼,彭德旺;猪环病毒感染与断奶后全身性消瘦综合征[J];当代畜牧;2001年02期
4 蒋玲艳,韦平,李义杰;鸡传染性贫血病毒的分子生物学及其核酸检测技术[J];动物医学进展;2003年05期
5 谢雯,何忠平,刘安楠;乙型肝炎患者中TTV的混合感染[J];实用肝脏病杂志;2000年01期
6 林佳佳,谢雯,何忠平,刘安澜,段雪飞;非甲~庚型肝炎患者中TTV感染的调查[J];实用肝脏病杂志;2003年02期
7 翁善钢;;鹦鹉常见DNA病毒性疾病研究综述[J];广东畜牧兽医科技;2012年02期
8 黄思晓;郭永建;;输血传播病毒的最新研究进展[J];国际检验医学杂志;2008年03期
9 吴新刚;陆淼泉;;TT病毒的分类及致病性研究[J];国外医学(微生物学分册);2003年05期
10 华丽;朱玲;史小红;梅淼;陈晓秋;;猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析[J];基因组学与应用生物学;2010年05期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 黄元;徐敏;陈少勤;王晓虎;向华;张健騑;;猪Torque teno病毒广东株的PCR检测和序列分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 周继勇;申会刚;;猪圆环病毒研究概况[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
3 曾秀;郭万柱;朱玲;徐志文;王印;梅淼;余庆;;ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性研究[A];第五届中国畜牧科技论坛论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李俊;猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制[D];山东师范大学;2012年
2 刘岳龙;鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建[D];扬州大学;2001年
3 王忠田;猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D];中国农业大学;2003年
4 杜娟;SEN病毒分子病毒学和流行病学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
5 芦银华;华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建[D];南京农业大学;2003年
6 赵俊龙;猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究[D];华中农业大学;2001年
7 周双海;猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞功能的影响[D];中国农业大学;2004年
8 温立斌;猪圆环病毒2型的分子流行病学研究[D];中国农业大学;2005年
9 朱玲;猪圆环病毒Ⅰ型、Ⅱ型全基因克隆及其基因交换重组的研究[D];四川农业大学;2005年
10 肖驰;猪繁殖与呼吸道综合征、猪瘟和猪圆环病毒病诊断DNA微阵列的构建及其检测技术研究[D];四川农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 翟少伦;猪群中三种新发小DNA病毒的分子流行病学研究[D];新疆农业大学;2010年
2 张伟;猪圆环病毒Ⅱ型新疆株的分离鉴定及ORF2基因的原核表达[D];新疆农业大学;2010年
3 魏宗;鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达[D];山东农业大学;2011年
4 邹金峰;鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研究[D];山东农业大学;2011年
5 侯军委;猪源TTV转录本的鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立[D];中国农业科学院;2011年
6 刘建波;猪输血传播病毒流行病学调查与Cap蛋白表达及感染性克隆构建[D];中国农业科学院;2011年
7 刘志伟;上海和内蒙古地区输血性传播病毒的流行病学调查及ORF1基因的克隆表达[D];内蒙古农业大学;2011年
8 赵玲;猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析[D];四川农业大学;2011年
9 许银平;抗猪圆环病毒2型卵黄抗体的研制及效果的研究[D];华中农业大学;2011年
10 刘禄;乙型肝炎病毒表型耐药分析方法建立的研究[D];桂林医学院;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 徐东平;周先志;;核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎耐药研究进展[J];传染病信息;2007年02期
2 倪宏,骆抗先,刘定燮,朱幼芙,马佩球,朱科伦;乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建[J];第一军医大学学报;2001年03期
3 徐东平;;乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义[J];解放军医学杂志;2009年06期
4 纪冬;刘妍;王耀;苏何玲;思兰兰;钟彦伟;徐东平;;慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价[J];解放军医学杂志;2009年06期
5 周伯平,马为民,孙彤,王火生,徐六妹,袁静,蒋小玲,付涌水;TTV在非甲-庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序[J];中华传染病杂志;1998年03期
6 骆抗先;章廉;王珊珊;聂军;葛娅;陈志英;俞守义;刘银燕;杨守昌;梁蔚芳;何海棠;焦成松;;一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学及病毒学的初步研究[J];中华肝脏病杂志;1998年03期
7 唐霓,黄爱龙,张秉强,闫歌,向明确,蒲丹,郭晖;1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达[J];中华肝脏病杂志;2003年08期
8 孟庆华,周育森,刘德恭,王海涛;TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨[J];中华实验和临床病毒学杂志;1998年02期
9 李文鹏;李彤;闫玲;刘宝明;庄辉;;1.2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制[J];肝脏;2008年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 苏堤,赵国强,卢新亚,陈宗德;正常人群中TTV感染的检测[J];河南医科大学学报;1999年03期
2 温淑娟,黄镇华,程群,谷祯梅,侯金林;15株中国TT病毒基因型鉴定和部分序列分析[J];中国病毒学;2000年03期
3 孙月庭,谭红,杜华;TT病毒的分子生物学特性及研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2002年02期
4 刘利民,邢培清,李建斌,胡军,陈宗德,周育森,王海涛;TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达[J];河南医科大学学报;2001年06期
5 李江,叶林柏,郜金荣,吴正辉;TTV武汉分离株DNA克隆和序列分析[J];中国病毒学;2003年01期
6 肖红,骆抗先,胡章勇,文维群,张明霞;TTV在恒河猴实验感染的初步研究[J];解放军医学杂志;2001年06期
7 何忠平!100011北京,周育森,张启云!100011北京,彭国爱!100011北京,王海涛,崔振宇!100011北京;北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定[J];中华实验和临床病毒学杂志;2000年01期
8 温淑娟,钟梅!510515广州,黄镇华!510515广州,程群!510515广州;输血相关病毒母婴传播的分子病毒学鉴定[J];解放军医学杂志;2000年01期
9 郭乃洲,王万相;PCR-微孔板杂交法检测不同人群TTV DNA[J];中国病毒学;2001年03期
10 梁蔚芳,杨守昌,何海棠,王燕军,肖红,刘定燮,吴爱华,章廉,骆抗先;一种新型DNA病毒(TTV)对恒河猴的实验感染[J];第一军医大学学报;1999年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘建波;郭龙军;危艳武;黄立平;吴洪丽;刘长明;;猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒(PCV)混合感染的检测及TTV遗传变异分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
2 曾耀星;郑煌煌;郑宣鹤;杨旭;黄力;;43名献血者PCR-TTV DNA检测结果分析[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年
3 肖爱欢;赵武;梁家幸;秦毅斌;何颖;李茂宁;李斌;侯韶毅;苏乾莲;梁保忠;黄伟坚;;广西猪戊型肝炎病毒ORF2扩增及抗原性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
4 杜平;刘学荣;黄银君;牟克斌;;猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5基因的克隆与分析[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
5 唐娜;曲光刚;王金良;苗立中;肖跃强;张倩;沈志强;;山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传特性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
6 ;The ORF4a of Human Coronavirus 229E Encodes an ion channel protein[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
7 陈建飞;王承宝;时洪艳;陈小金;张志榜;冯力;;猪流行性腹泻病毒的分子流行病学研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
8 毕鹏;吴志新;苏念;李莉娟;;斑点叉尾鮰病毒(CCV)的纯化及其结构蛋白的质谱鉴定[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
9 赵钦;孙亚妮;赵冀楠;王鑫杰;周恩民;;禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗原表位分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
10 涂亚斌;王柳;刘红全;仇华吉;童光志;;马传染性贫血病毒(EIAV)嵌合感染性分子克隆的体外构建[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 袁桐 诸玲珍;这里春意正浓[N];中国电子报;2001年
2 李妲娜;奥尔夫在中国[N];音乐周报;2000年
3 记者 孟涛;国检局严把猪肉进口关[N];中国食品质量报;2000年
4 胡德惠;从喊“狼来了”到“与狼共舞”[N];新华日报;2002年
5 尔冬尘;福费廷款款登陆[N];中国城乡金融报;2001年
6 洪静仪 陈欣 罗进;最大福费廷成交[N];中国城乡金融报;2001年
7 秦友国 黎锦云 毕纲;镇江成功办理首笔福费廷业务[N];中国城乡金融报;2002年
8 记者姜业庆;福费廷业务[N];中国经济时报;2002年
9 张国华 葛建新;贸易融资新途径[N];金融时报;2001年
10 记者 贾勤文;拓展国际金融新业务[N];上海金融报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王礞礞;猪源TTV:分子流行病学,全长序列分析及感染性分子克隆的构建[D];中国农业科学院;2011年
2 王晶晶;戊型肝炎病毒ORF3蛋白的功能研究[D];华中科技大学;2012年
3 何嘉玲;猪圆环病毒2型编码蛋白4的鉴定及其感染后的宿主免疫器官基因表达谱分析[D];浙江大学;2012年
4 赵钦;国内禽戊型肝炎病毒的分离鉴定及其抗原性的研究[D];山东农业大学;2011年
5 耿彦生;戊型肝炎病毒在家禽、家畜中的流行及其ORF3蛋白与人肝细胞蛋白相互作用的研究[D];北京协和医学院;2011年
6 邢福珊;PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2011年
7 姜一峰;高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒强弱毒毒力差异的分子基础研究[D];中国农业科学院;2012年
8 盛晔;斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltMNPV Ⅱ)BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析[D];苏州大学;2010年
9 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
10 姜中毅;猪传染性肝炎病毒的基因克隆及分子特征研究[D];甘肃农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 侯军委;猪源TTV转录本的鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立[D];中国农业科学院;2011年
2 陈津晶;118例广西重型β地中海贫血患者TTV,HGV感染状况调查[D];广西医科大学;2012年
3 刘志伟;上海和内蒙古地区输血性传播病毒的流行病学调查及ORF1基因的克隆表达[D];内蒙古农业大学;2011年
4 叶剑波;上海近郊某地区犬Torque Teno virus感染率调查及全基因组序列分析[D];上海交通大学;2011年
5 罗红林;献血标本中输血传播病毒(TTV)感染率初步分析及其意义[D];苏州大学;2007年
6 赵玲;猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析[D];四川农业大学;2011年
7 魏宗;鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达[D];山东农业大学;2011年
8 朱永豹;武汉地区戊型肝炎病毒基因型及ORF3基因变异的分析[D];华中科技大学;2011年
9 胡守彬;禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白抗原表位分析[D];山东农业大学;2012年
10 郭亮;戊型肝炎病毒ORF3的表达及其相互作用蛋白的筛选和鉴定[D];上海交通大学;2013年
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