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《中国农业科学院》 2011年
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溶磷微生物分离、应用及其相关基因的克隆与功能鉴定

龚明波  
【摘要】:从适应土壤定殖的溶磷微生物中筛选到一株适应生产的溶磷真菌,并进行了其土壤溶磷特性和溶磷机理初步研究,选取溶磷效果较好的菌株进行了溶磷相关基因的克隆、表达和功能鉴定,取得以下主要结果: 在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上,以透明圈为指示,通过初筛和复筛,获得效果稳定的细菌23株,分属6个属11个种;真菌16株,其中有9株草酸青霉(Penicillium oxalicum),2株变幻青霉(Penicillium variabile),1株刺孢青霉(Penicillium aculeatum)、1株绿色木霉(Trichoderma viride)、2株黑曲霉(Aspergillus niger)、1株构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。 菌株对不同难溶磷(磷酸三钙、磷酸锌、磷酸铝和磷酸铁)的溶解能力实验表明:细菌对不同种类难溶磷溶解能力差异显著,真菌的溶磷效果显著高于细菌,16株真菌显著降低PDB培养液的pH值,最低达到1.43,固体培养基上培养5 d能将各种难溶磷全部溶解。 通过16株真菌在不同土壤中的定殖能力和释放难溶磷的效果比较,筛选土壤中定殖和溶磷效果好的菌株。土培实验结果表明:真菌在土壤中具有较强的定殖能力;不同土壤中真菌的定殖能力差异显著,同一种的真菌在土壤中的定殖能力也差异显著。真菌释放土壤难溶磷的能力与其土壤定殖的能力显著相关,菌株定殖能力越强,释放土壤难溶磷效果越好。其中,真菌Z33、Zh、ZC、Zh3、ZI1、Z15、ZQ3和Z30在土壤中定殖效果较好,28 d时,菌株数量能达到起始值的10~48倍,有效磷含量增加44%~160%。 通过微生物与作物、土壤的匹配性实验,筛选适应玉米生产的溶磷真菌,并开展了溶磷菌对土壤微生物多样性影响分析。溶磷微生物与作物的匹配性实验表明:16株真菌在平板上对玉米根系分泌物的适应性差异显著, Z15+、Zh、ZQ3、ZI1、ZJ1和Z30能够利用玉米的根系分泌物快速生长,并且能溶解平板中的磷酸三钙。选取这6株真菌进行土培实验,结果也证明Z15~+、ZQ3、ZI1、Zh和Z30都能以玉米根系分泌物为营养进行繁殖,第21天时,菌株数量达到起始的9.70~48.03倍,土壤有效磷增加了62.08%~147.55%。在盆栽玉米的土壤中,ZI1和Zh定殖的速度最快,菌剂ZI1和Zh处理后,玉米干重和湿重显著增加,在大田试验中,菌株Zh连续2年都具有较高的增产作用,而菌株ZI1只在2010年的试验中具有较好的增产作用。因此本文获得适应大田玉米生产的溶磷真菌为构巢曲霉Zh。溶磷菌剂对土壤微生物的结构产生显著的影响,总体趋势为细菌、真菌、放线菌的数量比对照有所增加,土壤中微生物多样性变化与土壤中细菌数量变化成正相关,土壤中细菌数量越多,土壤微生物多样性越高。 选取具有较好增产效果的构巢曲霉Zh和草酸青霉ZI1,对其产酸的种类,不同温度条件下土壤溶液pH值的变化、菌株定殖能力以及土壤中不同级别难溶磷的转化规律进行研究,探讨了溶磷真菌在土壤中溶磷机理和溶磷特性。利用离子色谱对菌株产酸种类进行分析,结果表明:构巢曲霉Zh和草酸青霉ZI1在PDB溶液中能够大量产生乳酸和草酸,培养26 h时,溶液中乳酸和草酸的含量分别达到了372.5μg/mL和593.9μg/mL。菌株Zh和ZI1在15、20和30℃土培条件下,都有很强的定殖能力,并能使土壤溶液的pH值显著降低,土壤溶液pH值变化与菌株在土壤中定殖的规律一致。不同的温度下,菌株Zh和ZI1对土壤中不同级别的难溶磷的转化规律总体趋势一致,土壤中Ca_2-P、Ca_8-P、Al-P、Fe-P和Ca_(10)-P形态的无机磷含量都发生了变化,菌株Zh转化土壤中Ca_8-P量较高,而菌株ZI1对Al-P、Fe-P转化效率较高。菌株Zh和ZI1溶磷机理为菌株在土壤繁殖过程中分泌有机酸与铁、铝、钙等离子螯合,从而使难溶磷转化为有效磷。 构建黑曲霉Zh3和草酸青霉ZI1的cDNA文库,在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上以透明圈为指示,筛选溶磷克隆子,结果从菌株Zh3和ZI1的cDNA文库中分别筛选到携带溶磷相关基因的克隆子60个和72个,这些克隆子在第二代转接后功能稳定,确认这些克隆子所携带的基因具有溶磷的功能。黑曲霉Zh3文库中筛选的克隆子所携带基因序列全长为1407bp,与Aspergillus niger CBS 513.88和Aspergillus niger contig An07c0220的同源性达到98%,与其他菌的同源性低于80%,但目前还没报到该基因在溶磷功能方面的研究,将该基因命名为pag T。草酸青霉ZI1文库中筛选的克隆子所携带基因序列全长为1160bp,与Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255和Aspergillus niger CBS 513.88的同源性只有68%,与其他菌的同源性更低,表明该基因为一个新的基因,将该基因命名为ppg T。 分析溶磷相关基因ppq T和paq T的开放阅读框,构建重组表达载体,获得转化子,并分析转化子产生有机酸种类和溶液pH值的变化。草酸青霉ZI1中溶磷相关基因ppg T开放阅读框长702 bp,蛋白长233个氨基酸,该蛋白与Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255的Pc21g23580同源性最高,为59%,目前还没有该类蛋白的功能研究报道,确定本文获得的蛋白PPG-T为新的蛋白。黑曲霉Zh3中溶磷相关基因pag T开放阅读框长819 bp,蛋白长333个氨基酸,该蛋白与Aspergillus niger CBS 513.88的bax Inhibitor family protein同源性达到100%,但该蛋白还没有溶磷功能的报道,属于该蛋白的新功能。将ppq T和paq T的开放阅读框连接到pET28和pGEX表达载体中,构建了4株转化子,产生的乙酸和甲酸将难溶磷无机盐培养液的pH值降低到3.6左右,在LB培养中,4株转化子不能将溶液的pH值降低,表明基因的表达需要难溶磷的诱导。ppq T基因在E. coli. DH5α中的溶磷机理是将葡萄糖氧化生成乙酸,溶解无机磷;而paq T基因在E. coli. DH5α中的溶磷机理是将葡萄糖氧化生成乙酸和甲酸,溶解无机磷。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S144

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