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甘蓝类蔬菜的细胞质DNA多样性研究

张扬勇  
【摘要】:甘蓝类蔬菜(Brassica oleracea L.)属于十字花科芸薹属,包含结球甘蓝、青花菜、花椰菜、球茎甘蓝、芥蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝等七个栽培变种。2006年全国结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata L.)的种植面积达93.73万公顷。结球甘蓝杂交种的生产主要利用自交不亲和系和雄性不育系两种途径,其中雄性不育系包括显性核基因雄性不育(DGMS)和改良的Ogura萝卜胞质不育(CMS)。但雄性不育系的利用存在胞质单一的风险。从分子水平研究甘蓝变种间和变种内的细胞质DNA多态性,为显性雄性不育系和胞质不育系的胞质多样化提供科学依据,而且对于阐明甘蓝各变种的进化路线具有重要意义。 本研究利用甘蓝类蔬菜不同变种间和变种内材料,以开发的叶绿体SSR(cpSSR)和线粒体SSR(mtSSR)引物进行多态性筛选;利用全基因组重测序结果,全面揭示六份结球甘蓝材料间的细胞质DNA多样性;以获得的特异SNP或CAPS标记进行Ogura CMS不育系或DGMS不育系胞质多样性的验证。研究结果如下: 1.利用已公布的拟南芥叶绿体、油菜线粒体全基因组序列,首次开发出可在结球甘蓝上应用的cpSSR和mtSSR引物。分别搜索获得89个叶绿体基因组SSRs(cpSSRs)、29个线粒体基因组SSRs(mtSSRs),SSR出现频率分别为1.736 kb/ 1个SSR、7.650 kb/ 1个SSR。针对这些SSR设计cpSSR引物58对、mtSSR引物21对,能在结球甘蓝上应用的cpSSR引物32对、mtSSR引物21对。在32对cpSSR引物中,5对引物在结球甘蓝自交系C300、C322和波里马油菜N478、N479间有扩增产物多态性,这些多态性片段均位于基因内含子区或基因间隔区。多态性片段测序结果显示单核苷酸A/T重复数从8个到13个不等,相似性比较表明C300、N479间的相似性大于两者与拟南芥之间的相似性。21对mtSSR引物均未在甘蓝C300、C322和波里马油菜N478、N479间检测到多态性,表明线粒体DNA的保守程度比叶绿体要高。这些细胞质SSR引物在结球甘蓝上的成功应用,为甘蓝类蔬菜细胞质多样性研究提供了基础。 2.利用开发的cpSSR引物进行甘蓝类蔬菜不同变种间细胞质DNA多态性筛选,首次获得了具有变种特异性的叶绿体单核苷酸多态性(SNP)标记,并成功将其转化为dCAPS标记。以32对在结球甘蓝上应用的cpSSR引物对结球甘蓝、青花菜、花椰菜、芥蓝、球茎甘蓝等5个不同变种进行标记筛选,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上没有获得扩增产物长度多态性。对这32对引物的PCR扩增产物进行测序,利用DNAstar软件比对发现1个SNP位点,该位点初步呈现变种特异性。为简便快速鉴定该SNP位点,将其成功转化为衍生的酶切扩增多态性序列(dCAPS)标记—ACP43-93 RsaⅠ。以该dCAPS标记对甘蓝类蔬菜不同变种的206份材料进行筛选,进一步验证了该标记的变种特异性。全部花椰菜和大部分青花菜为同一单元型,其它甘蓝变种为另一单元型,由此推测青花菜和花椰菜的分化时间相对较晚。同时,利用三个甘蓝变种的雄性不育回交群体明确了该叶绿体SNP为母性遗传标记。 3.采用Solexa基因组重测序方法,以结球甘蓝02-12新组装的叶绿体和线粒体基因组全长序列为参考,全面揭示六份结球甘蓝材料(Ogura CMS R_1、R_2、R_3、自交系60Tian、87-534、DGMS87-534)的叶绿体、线粒体基因组DNA序列多态性。与02-12相比,异源胞质雄性不育材料Ogura CMS R_1、R_2、R_3在叶绿体基因组水平上的SNP个数分别为1010、357、62,在线粒体基因组水平上的SNP个数分别是630、599、108,这些不育系的SNP数量在Ogura CMS R_1、R_2、R_3中呈现逐步减少的趋势,表明异源胞质含量越少,胞质不育系的应用前景就好。与结球甘蓝自交系Bo-1相比,Ogura CMS R_3特有的9个叶绿体SNPs、49个线粒体SNPs、3个线粒体插入和缺失变异(InDels),将为今后Ogura胞质不育系的进一步改良提供有效的筛选标记。在三份结球甘蓝材料Bo-1、Bo-7、Bo-8中,各自特有的叶绿体SNP个数分别为4、21、0,线粒体SNP个数分别为9、18、2,特有的线粒体InDels个数分别为0、3、0,表明结球甘蓝变种内材料间具有细胞质多样性,为DGMS不育系的胞质多样化提供依据。 4.以开发的32对cpSSR和21对mtSSR引物,对两种可实用的结球甘蓝Ogura CMS不育源CMS R_3、CMS HY进行分子鉴别,发现了在可实用Ogura胞质不育源中的胞质多样性。在cpSSR水平上,无法在聚丙烯酰胺凝胶电泳上获得多态性,经测序仅发现两种不育源在ACP9引物上存在SSR重复数的变异。在mtSSR水平上,仅mtSSR_2引物可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上区分这两种不育源,经测序发现其余5对mtSSR引物的扩增产物上存在9个多态性差异,其中3个为SSR位点重复数的变异。将其中2个可被MseⅠ酶切的多态性位点转化成CAPS标记,分别命名为m92-143 MseⅠ、m1-346 MseⅠ。这些标记表明CMS HY是一种不同于CMS R_3的改良结球甘蓝Ogura CMS雄性不育源。以CMS HY为不育源进行3个优良结球甘蓝自交系的转育,现已获得回交6代、花器官正常、结实性良好的优良雄性不育系。因此通过鉴别两种可实用的Ogura CMS不育源,发现了在可实用Ogura胞质不育源中的胞质多样性。 5.采用微量花粉回交法,成功获得替换胞质的DGMS-T不育系四份,并进行了胞质来源鉴定。以结球甘蓝DGMS不育系微量花粉为父本,以不育系相应保持系为母本,杂交后获得了四份DGMS-T不育系——07-556、07-1005、07-1006、07-1007。田间鉴定表明在DGMS不育系的不育性遗传、不育稳定性、花器官形态、结实性、田间植株性状等方面,胞质替换前后并没有显著性差异。以DGMS不育源79-399-3及回交父本60Tian间特有的SNP标记和CAPS标记,验证了不育系DGMS-T 60Tian的胞质来源为其回交父本。总之,本研究的微量花粉回交法提供了一条实现DGMS不育系胞质多样化的途径,DGMS不育系胞质的成功替换实现了DGMS不育系的胞质多样化。


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