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《中国农业科学院》 2010年
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毒死蜱降解菌Klebsiella sp. CPK魔斑合成酶基因的鉴定及功能分析

王圣惠  
【摘要】:毒死蜱是一种广谱中等毒性的有机磷杀虫剂。近几年来,由于毒死蜱广泛使用而带来的环境污染问题已经受到人们的普遍关注。本研究采用富集分离法分离了一株毒死蜱降解细菌Klebsiella sp. CPK,通过Native-PAGE和TOF-MS测序发现毒死蜱胁迫能够触发该菌的严谨反应。以该菌株为研究对象,采用分子生物学和生物信息学等研究方法,开展了Klebsiella sp. CPK菌株对毒死蜱降解、魔斑合成酶基因克隆、表达及功能分析的研究,旨在为进一步阐明魔斑作为一种调节因子可能参与毒死蜱生物降解的调控作用奠定基础。主要研究内容如下: 采用富集分离法从活性污泥中分离到一株毒死蜱降解菌株CPK,该菌株能够利用毒死蜱为唯一碳源、能源生长,并且能将毒死蜱转化为三氯吡啶酚。通过形态学、生理生化和16S rRNA序列同源性分析,将其鉴定为Klebsiella sp. CPK,其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号为GU301269。采用气相色谱法检测CPK菌株对50mg/L的毒死蜱的降解,结果表明在每升0.2g细胞干重的接种量下,Klebsiella sp. CPK菌株在11天内对毒死蜱的降解率为80%。采用高效液相色谱检测CPK菌株对毒死蜱的代谢途径,结果表明三氯毗啶酚为其主要的代谢产物,但随着毒死蜱的降解,三氯吡啶酚在培养液中的浓度不断升高且不能被进一步代谢。因此,同大多数的好氧细菌一样,Klebsiella sp. CPK只能将毒死蜱转化为三氯吡啶酚,却不能降解三氯吡啶酚。 本文采用Native-PAGE技术从毒死蜱胁迫下的Klebsiella sp. CPK菌株全细胞蛋白中分离到一种特异蛋白,该蛋白通过TOF-MS测序鉴定为魔斑合成酶RelA。对该蛋白编码基因进行PCR扩增,并利用ORF Finder、showorf等生物信息学软件对其开放性阅读框架进行鉴定,获得了一个全长为2238bp的完整relA基因,其在GenBank中的注册号为GU301270。序列及系统发育分析表明,Klebsiella sp. CPK菌株的RelA蛋白与E.coli的RelA蛋白的相似性为92%,但与双功能的Rel-SpoT蛋白相似性却比较低,由此推测Klebsiella sp. CPK RelA蛋白可能只有魔斑合成酶活性。另外,对CPK菌株毒死蜱胁迫下魔斑积累的检测和对relA基因进行功能互补分析表明,Klebsiella sp. CPK RelA蛋白只具有魔斑合成酶活性,从而证明了Klebsiella sp. CPK菌株在毒死蜱胁迫下能够产生典型的严谨反应。 采用同源重组技术敲除了Klebsiella sp. CPK菌中魔斑合成酶编码基因relA,获得了一株relA基因敲除的ArelA菌株,并通过PCR及RT-PCR扩增对其敲除进行验证。分别采用分光光度法和气相色谱法检测该突变体对几种胁迫因子的耐受性和对毒死蜱的降解。结果表明,与野生型的CPK菌株相比,ArelA菌株对几种环境胁迫因子,如高盐、低pH值、高温、高浓度毒死蜱等条件的耐受能力和对毒死蜱的降解能力均明显弱于野生型的CPK菌株。有趣的是在不同浓度的毒死蜱胁迫下,CPK菌株的生长曲线和半定量RT-PCR结果表明毒死蜱的胁迫能够影响CPK菌株的生长和relA基因的表达。另外,生物降解的结果表明,relA基因的表达在CPK菌株对毒死蜱生物降解的过程中起着重要作用。 上述结果表明,毒死蜱胁迫能够触发Klebsiella sp. CPK菌株的严谨反应并且发现魔斑在毒死蜱的生物降解中起着重要作用。比较特殊的是,该严谨反应不是在营养限制的条件下产生的,如碳源饥饿、氨基酸饥饿,而是在含有毒死蜱的营养丰富的培养基中产生。需强调的是,由实验结果可以推测,在Klebsiella sp. CPK菌株中魔斑调节着环境的胁迫反应、毒死蜱的耐受性和毒死蜱的降解。这种调控作用还可能涉及到其它有毒化合物质,异生质及环境污染物的去毒和降解。这些结果为更好地了解微生物生物修复的调控机制奠定了理论基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:X172

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