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《中国农业科学院》 2012年
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蜡蚧轮枝菌毒力改良及其效果评价

翟晓曼  
【摘要】:蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)寄主范围广,对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马和害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果,但存在杀虫效果较慢等问题。蝎神经毒素是由60至70多个氨基酸残基组成的多肽链家族,其对昆虫具有毒杀作用。本研究将克隆东亚钳蝎挛缩性毒素BmKIT基因,将其与真菌强启动子TrpC基因连接后,采用农杆菌介导的方式转入到蜡蚧轮枝菌中,使蜡蚧轮枝菌杀死害虫所需时间缩短,提高蜡蚧轮枝菌的杀虫速度。研究取得如下结果: 1、克隆了蝎毒BmKIT基因:剪取东亚钳蝎的尾节,用Trizol法从尾节中提取东亚钳蝎的总RNA,以总RNA为模板,反转录合成cDNA第一链,根据已报道的BmKIT基因的核苷酸序列设计引物,用设计好的引物进行PCR扩增,获得了挛缩型昆虫蝎毒素BmKIT片段。测序结果表明,其长度为213bp。序列比对结果表明与前人已报道的序列一致。 2、构建了表达载体:将得到的BmKIT基因用SacI和BamHI酶切;从pBHt2质粒中扩增出TrpC基因(367bp),用HindIII和SacI进行酶切,产物经凝胶电泳检测,并回收;将经过酶切的TrpC基因和BmKIT基因连接,产物测序结果显示其大小为580bp,与预想结果一致;将TrpC-BmKIT连接到真菌表达载体pBHt2的T-DNA区后,将含有TrpC-BmKIT基因的pBHt2质粒转入大肠杆菌感受态细胞中,构建了带有BmKIT基因表达特性的真菌表达载体。 3、BmKIT基因转化蜡蚧轮枝菌:将TrpC-BmKIT连接片段转入农杆菌菌株AGL-1中,然后采用农杆菌介导法将含有TrpC-BmKIT的pBHt2质粒转进蜡蚧轮枝菌菌株CA14菌株中。 4、转化子的筛选与验证:从50株假定转化子中,用CTAB法提取DNA并进行PCR验证,结果表明,其假阳性概率为8%(4株);对阳性46株转化子进行的RT-PCR检测结果表明,蝎毒基因BmKIT可以正常转录;将46株转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上继代培养20代后,再转接到含有潮霉素B的PDA上培养,结果有43株(93.5%)可以正常生长,遗传稳定。 5、转化子的生物活性测定:以菜蚜为试虫,通过浸渍法测定转BmKIT基因的转化子菌株T-1、T-2和T-3的毒力。试验结果表明,转BmKIT基因菌株的杀虫速度明显提高。第4d,原始菌株对蚜虫的致死率为21.1%,三个转化子对蚜虫的致死率达46.7%-48.9%;第6d,原始菌株对蚜虫的致死率为76.67%,三株转化子对蚜虫的侵染致死率均达到100%,且多数死亡虫体的表面长出了蜡蚧轮枝菌菌丝。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S476.1

【参考文献】
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