水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号蛋白基因PXO_01021功能的初步研究

【摘要】：由水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，简称Xoo)引起的水稻白叶枯病是世界上最重要的水稻细菌性病害之一。在与水稻互作过程中，Xoo通过一系列的信号调控系统对寄主植物的侵染过程进行分子和细胞等水平上的调控。环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是在细菌中新发现的、新型的第二信使，与细菌的多种生物学性状(如毒性、致病性)的调控有关。在Xoo基因组中含有多个与c-di-GMP代谢(合成和降解)相关的基因，PXO_01021就是其中一个含有与c-di-GMP代谢相关的GGDEF和EAL保守结构域的基因，另外它还含有信号接收结构域PAS。但至今尚不清楚其功能、表达与调控。本研究对该基因的功能及其可能感应接受的外源信号分子开展了相关研究，主要结果如下： （1）利用同源置换方法，构建了该基因的缺失突变体ΔPXO_01021，进行了突变体致病性、生物膜形成、运动性、致敏性等生物表型的检测。与野生型菌株PXO99A相比，ΔPXO_01021突变体致病性明显增強，生物膜形成能力减弱，运动性以及对烟草致敏性无明显变化，基因互补可以使突变体表型部分恢复到与野生型相同。 （2）利用RT-qPCR方法，检测了PXO_01021基因在不同离体培养条件(模拟水稻维管束组织环境：低氧和中性偏酸，及不同铜离子浓度)下的转录动态。发现PXO_01021的表达明显地受到氧(O2)浓度的影响。 pH值并不影响PXO_01021的表达。在有Cu~(2+)存在的生长条件情况下，PXO_01021表达明显上调，并在一定范围内具有剂量效应。 （3）为了分析PXO_01021基因启动子活性及其对外界信号分子的感应，构建了该基因启动子PXO_01021-p::gfp的载体，并将其导入Xoo野生型菌株PXO99A感受态细胞中，可定性地观察到GFP绿色荧光，但不够定量检测。说明该启动子虽然具有活性，但需要进一步优化定量分析条件。 （4）对PXO_01021/PXO_01020/PXO_01019/PXO_01018基因簇进行转录分析，其中PXO_01021和PXO_01018的转录方向是一致的，且是单个基因转录， PXO_01019和PXO_01020的转录方向一致，且是共转录单元。 总之，本研究从Xoo中成功克隆到c-di-GMP信号蛋白PXO_01021基因，并构建了基因的缺失突变体和互补菌株。研究表明：该基因具有正向调控生物膜形成和负向调控致病性的作用；氧分子和Cu~(2+)显著影响PXO_01021基因的表达；在野生型PXO99A菌株中，PXO_01021基因启动子具有生物学活性；PXO_01021/PXO_01020/PXO_01019/PXO_01018基因簇中，PXO_01021和PXO_01018都是单独转录的，而PXO_01020和PXO_01019是共转录的。 此外，通过RT-qPCR方法，检测了Xoo中DSF信号蛋白基因突变体ΔrpfF、ΔrpfC和ΔrpfG中三型分泌系统相关hrp基因的表达情况，发现DSF信号系统能够调控三型分泌系统相关基因的表达。