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《中国农业科学院》 2012年
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H5亚型禽流感DNA疫苗的细胞免疫应答及联合免疫研究

赵双成  
【摘要】:高致病性禽流感(HPAI)是由一些H5和H7亚型流感病毒所引起的高致病性和高死亡率的烈性禽类传染病,已对养禽业构成严重威胁,并具有重要的公共卫生意义。DNA疫苗是预防禽流感最具潜力的基因工程疫苗之一,DNA免疫不仅能诱导较好的抗体反应和特异性的细胞免疫反应,还具有安全稳定、不受宿主种属限制、可反复加强免疫、免疫持续期长等突出优点。 表达H5亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GS/GD/1/96]HA基因的DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5免疫效果良好,目前已完成临床试验,正在申请新兽药证书注册。鉴于现地免疫影响因素众多以及目前我国H5亚型禽流感不同抗原群并存的复杂状况,了解和评价DNA疫苗免疫后的细胞免疫应答状况,探讨不同抗原群DNA疫苗的联合免疫的可能性,将为DNA疫苗的推广应用提供有用的数据支撑。 为获得GS/GD/1/96的HA蛋白,将GS/GD/1/96的HA基因片段克隆于杆状病毒表达系统的转移载体pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBacmid-HA5)。采用间接免疫荧光(IFA)、Western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达了分子量约为64ku的重组蛋白;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具备良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具备良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为评价DNA疫苗的细胞免疫水平、研究HA基因功能活性及制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。 为了解H5亚型DNA疫苗免疫后的细胞免疫应答反应,将DNA质粒pCAGGoptiHA5以15μg剂量间隔3周两次免疫SPF鸡,第二次免疫后2周用105EID50的GS/GD/1/96进行致死性攻击,免疫以及攻毒后,用流式细胞术检测试验鸡外周血及脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类百分含量的动态变化,利用MTT法进行T淋巴细胞增殖实验分析,同时采用ELISA方法检测血清中IFN-γ、IL-2的含量变化。结果表明:外周血及脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类百分含量具有类似的变化趋势,免疫后CD4+、CD8+T淋巴细胞相对百分含量明显高于非免疫组(p0.05),CD4+T细胞于第二次免疫后一周达到峰值,攻毒后CD4+含量略有下降但变化不明显;CD8+T淋巴细胞含量也于加免后一周达到峰值,攻毒后二周仍然处于上升趋势;首次免疫后CD4+/CD8+比例逐渐升高,并于加免后一周达到峰值。ConA刺激免疫组和对照组淋巴细胞后,细胞大量增殖,但两组间差异不显著(p0.05);表达蛋白刺激后,两组间差异显著(p0.05)。免疫组血清中IFN-γ、IL-2的含量均高于同期对照组(p0.05),并于第二次免疫后一周达到峰值,攻毒后略有上升。而非免疫组SPF鸡外周血中CD4+、CD8+淋巴细胞的数量、CD4+/CD8+比例以及血清中IFN-γ、IL-2的含量并没有显著变化,并于攻毒后一周内全部死亡。结果表明,DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5免疫后可诱导较强的细胞免疫应答。 为探讨H5亚型不同抗原群禽流感DNA疫苗联合免疫的可能性和协同免疫保护效力,将DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5、pCAGGoAHHA和pCAGGSXHA分别等量混合,以15μg、30μg、45μg、60μg和90μg总剂量联合免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后3周以相同的剂量和途径进行第二次免疫,加强免疫后2周分别用105EID50的A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GS/GD/1/96]、A/Duck/Fujian/31/2007(H5N1)[DK/FJ/31/2007]及A/Chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)[CK/SX/2/2006]通过鼻腔途径进行攻击,每天观察发病和死亡情况,并于攻毒后第3、5、7天分别采集喉头和泄殖腔拭子,进行病毒的分离和滴定。同时检测免疫后和攻毒后血清HI抗体水平。结果表明,3种质粒以60μg和90μg剂量两次联合免疫后,免疫鸡均可对不同抗原群病毒的攻击提供100%的完全保护(不发病、不排毒、不致死),15μg剂量联合免疫后可对GS/GD/1/96和DK/FJ/31/2007的攻击提供90%和80%的死亡保护;CK/SX/2/2006攻击后,15μg和30μg剂量组的免疫保护率分别为80%和90%,45μg剂量能提供100%的致死保护。结果显示,3种质粒疫苗联合免疫效果良好,可实现有效的交叉保护,减少免疫次数,DNA疫苗联合免疫有望成为抵御不同抗原群H5亚型禽流感的有效免疫策略。 本研究结果表明,DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5可激发SPF鸡产生较强的细胞免疫应答;3种质粒pCAGGoptiHA5、pCAGGoAHHA和pCAGGSXHA联合免疫效果良好,这将为禽流感DNA疫苗的产业化以及现地应用提供必要的科学依据和支持。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.4

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【参考文献】
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