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《中国农业科学院》 2012年
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普通小麦籽粒多酚氧化酶及黄色素含量相关基因克隆与表达机理分析

孙友位  
【摘要】:面粉及面制品颜色是重要的品质性状,克隆颜色性状相关基因,并深入分析其表达机理对于小麦品质改良具有重要意义。本研究利用PCR技术筛选普通小麦小偃54基因组BAC文库,获得了籽粒多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)和八氢番茄红素合酶(Phytoene synthase,PSY)基因,分析了籽粒不同发育时期PPO和PSY基因的表达模式,阐述了Ppo-A1基因的选择性剪接分子机制。此外,同源克隆了普通小麦第五同源群染色体上的ζ-胡萝卜素异构酶(ζcarotene isomerase,Z-ISO)基因。主要结果如下: 1.在同源克隆基础上,根据普通小麦Ppo-A1、Ppo-B1和Ppo-D1基因的序列信息设计保守引物,利用PCR技术筛选普通小麦小偃54基因组BAC文库,共得到7个阳性BAC克隆,其中207-2-3、207-3-3、207-12-1和910-9-4阳性克隆来源于2A染色体;780-4-7阳性克隆含Ppo-B1a基因,来源于2B染色体;1376-2-3和1376-4-1则来源于2D染色体。利用Sau3A I分别对207-12-1、780-4-7和1376-2-3阳性克隆进行酶切消化,回收3-6kb质粒DNA片段,构建了含有768个、1182个和768个单克隆的亚克隆文库。PCR筛选亚克隆并测序,获得了2A、2B和2D染色体上包含启动子和3'UTR等调控区序列信息的PPO基因,长度分别为5,447bp、10,073bp和4,295bp。图位克隆获得的Ppo-A1、Ppo-B1和Ppo-D1基因编码区与同源克隆序列一致,证实了小麦基因同源克隆的可行性,同时获得了基因启动子和3'UTR调控区完整的序列信息。 2.对开花后不同发育时期的小麦籽粒进行L-DOPA完整籽粒染色和PPO蛋白活性检测,表明在籽粒发育后期及成熟种子中,具有Ppo-A1a等位基因品种的籽粒染色密度和PPO蛋白活性明显高于具有Ppo-A1b等位基因的品种。在籽粒发育早期(开花后7天),具有Ppo-D1a等位基因的品种PPO蛋白活性稍高于具有Ppo-D1b等位基因的品种。小麦籽粒发育初始阶段籽粒染色密度和PPO蛋白活性较低,随后染色密度和PPO活性逐渐升高。低温保存1年后的成熟籽粒染色密度和PPO活性达到最高。 3.采用半定量RT-PCR技术分析了4个高PPO活性和4个低PPO活性普通小麦品种Ppo1基因的时空表达模式。Ppo-A1基因在籽粒中特异表达,且在开花后14-28天表达水平最高,随着籽粒成熟表达水平迅速降低。在籽粒发育过程中,Ppo-A1a等位基因品种的基因表达水平高于Ppo-A1b等位基因品种。第一内含子191bp插入序列和第二外显子C/G SNP导致Ppo-A1b基因前体mRNA产生选择性剪接,形成8种转录本。只有组成性转录本编码的多肽链可以合成完整PPO蛋白,其余7种转录本均含有提前终止密码子。Ppo-D1b基因表达模式与Ppo-A1基因类似,但Ppo-D1a基因在开花后7天籽粒发育时期有较高转录表达水平,随之降至低水平稳定表达。应用原核表达体系成功地表达了Ppo-A1基因,获得了分子量约67kDa的重组PPO蛋白。利用Western Blotting技术初步鉴定了籽粒发育时期PPO基因蛋白水平表达模式。 4.根据普通小麦Psy-Ai、Psy-B1和Psy-D1基因的序列信息设计保守引物,利用PCR方法筛选小偃54基因组BAC文库,共得到7个阳性BAC克隆,287-11-4、436-12-6、988-6-8、808-2-6、1083-5-5、900-12-7和1036-10-7。808-2-6和1083-5-5来源于7B染色体,900-12-7和1036-10-7来源于7D染色体。但未获得7A染色体上Psyl基因的BAC阳性克隆。分别构建1083-5-5和900-12-7BAC克隆的亚克隆文库,筛选含Psyl基因阳性亚克隆并测序,获得了长度为9,173bp和5,073bp包括启动子和3'UTR调控序列的Psy-B1和Psy-D1基因。 5.采用半定量RT-PCR技术分析了Psy-A1基因的转录表达模式。Psy-A1基因表达水平随籽粒发育呈动态变化模式,其mRNA丰度在籽粒发育早期具有较高水平,开花后21天迅速降低至较低水平,直至开花后35天时方恢复至较高水平。利用锚定于第三外显子和3'UTR区的引物检测Psy-A1a与Psy-A1b等位基因在籽粒各发育时期的mRNA丰度,发现两类品种的mRNA丰度无明显差异。 6.利用同源克隆策略成功克隆了普通小麦第五同源群染色体上Z-ISO基因,获得了5D染色体上Ziso-D1基因全长编码序列,以及5A和5B染色体上Ziso-A1和Ziso-B1位点的部分序列。Ziso-D1a基因ORF全长3,250个核苷酸碱基,含4个外显子和3个内含子。在普通小麦品种中国春、中优9507和CA9632中分别鉴定了Ziso-A1基因位点的3个等位变异,即Ziso-A1a、Ziso-A1b和Ziso-A1c。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S512.1

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