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紫花苜蓿浓缩单宁合成途径中DFR和ANR基因的分离及遗传转化

董洁  
【摘要】:紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上分布最广的一种多年生豆科牧草,它不仅产量高而且营养丰富,被誉为“牧草之王”。然而反刍动物大量采食后易发生臌胀病,严重限制了这种优良牧草在畜牧业中的利用与营养潜力的发挥。紫花苜蓿中的浓缩单宁(condensedtannins, CT)含量低是引起反刍动物臌胀病的原因,因此适量提高紫花苜蓿中单宁的含量,降低反刍动物臌胀病的发生几率,具有重要的实践意义。 本试验主要研究紫花苜蓿浓缩单宁合成途径中的两个重要基因:二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase,DFR)和花青素还原酶(anthocyanidin reductase,ANR),取得了如下进展: 1.以紫花苜蓿荚果为试验材料,采用RT-PCR方法克隆得到紫花苜蓿DFR基因的cDNA序列,该片段开放阅读框1020bp,编码339个氨基酸。序列比对分析发现,所获得的序列与近缘植物的DFR基因序列有较高的相似性,与蒺藜苜蓿达到97%,说明该基因为紫花苜蓿DFR基因,命名为MsDFR,并在Genbank中登陆JF931173。 2.通过实时定量的方法揭示MsDFR在不同组织和不同胁迫条件下的表达量。结果表明:MsDFR在荚果中的表达量最高。该基因的表达还受到高盐和干旱胁迫诱导,同时也受到外源激素GA诱导,以及伤害胁迫的诱导。 3.构建表达载体pCAMBIA1302-MsDFR-GFP,进行亚细胞定位研究。将质粒用基因枪轰击的方法转入洋葱表皮细胞,结果表明:MsDFR蛋白定位于细胞质中。 4.构建表达载体pBI121-MsDFR-GUS,通过农杆菌介导法转化拟南芥,期望得到MsDFR超量表达的转基因植株。经过后代的筛选培养和分子检测,确定MsDFR基因已经整合到拟南芥基因组中。MsDFR转基因植株中的浓缩单宁含量比对照植株有所提高,但是差异并不明显。 5.以紫花苜蓿荚果为试验材料,采用RT-PCR方法克隆得到紫花苜蓿ANR的cDNA序列,该片段开放阅读框为1017bp,338个氨基酸。序列比对分析发现,该核苷酸序列与蒺藜苜蓿,三叶草,百脉根,红花菜豆等的ANR基因核苷酸序列有较高的相似性,与蒺藜苜蓿达到95%。由此证实获得的序列是紫花苜蓿ANR基因的全长cDNA序列,命名为MsANR,并在Genbank中登陆HM754630。 6. MsANR基因以单拷贝形式存在于紫花苜蓿基因组中,且该基因的DNA序列由六个外显子和五个内含子组成。 7.采用染色体步移的方法得到了MsANR基因的启动子序列,包含TATA-box和激活元件CAAT-box。还有光感应元件:ACE、Box-4、BoxI、G-Box、GA-motif、GAG-motif、GT1-motif、Chs-Unit1ml、Sp1和TCT-motif。此外还有脱落酸响应元件ABRE;赤霉素响应元件GARE-motif和TATC-Box;MYB转录因子结合区域;ERF转录因子结合区域;抵御胁迫响应元件TC-rich repeats和抗氧化元件ARE。 8.通过实时定量的方法揭示MsANR在不同组织和不同胁迫条件下的表达量。结果表明:MsDFR在荚果中的表达量最高。该基因的表达量也受到高盐和干旱胁迫诱导,同时受到外源激素ABA和GA诱导,以及伤害和黑暗条件胁迫的诱导。 9.构建表达载体pCAMBIA1302-MsANR-GFP,进行亚细胞定位研究。采用PEG融合的方法转入拟南芥原生质体,用激光共聚焦显微镜观察结果表明,MsANR蛋白定位于细胞核和细胞质中。 10.将含有完整开放阅读框的MsANR基因片段插入pET-30a(+)构建了原核表达载体pET30a-ANR,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明该融合蛋白能高效表达。 11.将构建的表达载体pCAMBIA1302-MsANR-GFP,通过农杆菌介导法转化拟南芥,期望得到MsANR超量表达的转基因植株。经过后代植株的筛选培养和分子检测,确定MsANR基因已经整合到拟南芥基因组中。浓缩单宁的含量检测表明:转基因植株单宁含量显著高于对照植株。说明外源ANR基因的导入可能参与植物内源浓缩单宁的代谢合成,MsANR基因在单宁合成途径中起着极为重要的作用。


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